趨化因子CXCL11-I-TAC和CCL22-MDC在病理性瘢痕中的表達.pdf

1、實驗目的: 瘢痕是各種皮膚損傷誘發(fā)的連鎖性體液—細胞反應，導致以纖維蛋白為主的修復過程的產(chǎn)物。根據(jù)其組織學和形態(tài)學區(qū)別，可分為四類：表淺性瘢痕、萎縮瘢痕性、增生性瘢痕，瘢痕疙瘩。其中增生性瘢痕(hypertrophic scar，HTS)和瘢痕疙瘩(keloid，K)又統(tǒng)稱為病理性瘢痕(pathological scars)。臨床上病理性瘢痕不但發(fā)病率高，嚴重影響人類生存質量，而且有惡變傾向。目前，由于創(chuàng)面愈合的多細胞參與、多階

2、段發(fā)展、多空間變化的復雜性等原因，病理性瘢痕形成的具體機理仍不清晰。本研究基于瘢痕形成的免疫學假說，首次研究Th1趨化因子——干擾素誘導的T細胞α類趨化因子(CXCL11/Ⅰ-TAC)和Th2趨化因子——巨噬細胞來源的趨化因子(CCL22/MDC)在病理性瘢痕組織中的表達，探討其在病理性瘢痕發(fā)病機制中的作用。 實驗方法: 瘢痕疙瘩患者24例為A組，男性11例，女性13例，年齡9—45歲，平均29±16.7歲，病變部位包括

3、前胸、肩背部及耳垂等，病程1.5年—28年。增生性瘢痕患者33例為B組，男性13例，女性20例，年齡13—58歲，平均36±21.2歲，病變部位包括面部、前胸、背部及四肢等，病程7個月—21年。瘢痕表面無感染及潰瘍，表面顏色由紅至白不等，術前未行激光、冷凍、外用或局部注射藥物等任何治療，患者無皮膚、免疫及傳染性疾病。同時選取其他整形美容手術患者切除的正常皮膚組織15例，作為對照C組。將新鮮組織置于冰盒內轉運到實驗室，行OCT包埋，—80

4、℃保存，實驗前將標本塊經(jīng)冰凍切片機制成5μm厚的冰凍切片。丙酮固定30分鐘干燥后，PBS沖洗3次，3％過氧化氫抑制內源性過氧化物酶活性10分鐘，PBS沖洗3次，免疫血清阻斷非特異性抗原10分鐘，在每個標本分別加30μl一抗即Ⅰ-TAC或MDC(1：50稀釋)，4℃濕盒過夜，PBS沖洗3次后，滴加1：200稀釋生物素化二抗，37℃恒溫孵育20分鐘，PBS沖洗3次，滴加1：200稀釋ABC復合物即三抗，37℃恒溫孵育20分鐘，PBS沖洗3次

5、；滴加50μlAEC染液復染，鏡下觀察控制染色效果，染色時間約3—10分鐘，自來水洗凈，室溫晾干；蘇木精復染3—5秒鐘；用流水沖洗30分鐘，氨水反藍；陰性對照組省略第一抗體，用PBS緩沖液代替。封片，保存，鏡下觀察，照相。結果判斷標準：Ⅰ-TAC和MDC著色后細胞漿呈紅色顆粒狀，為陽性表達。每例標本選取10個高倍鏡視野(×400)計數(shù)，采用雙人盲法，檢測切片中陽性細胞占同類細胞總數(shù)的百分數(shù)和陽性細胞的著色強度，應用半定量分級方法將其分為

6、4個等級：①陽性細胞數(shù)少于細胞總數(shù)的10％，為(-)；②陽性細胞數(shù)為細胞總數(shù)的10％——30％，細胞漿呈淺紅色，為(+)；③陽性細胞數(shù)為細胞總數(shù)的30％——60％，細胞漿呈紅色，為(++)；④陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)60％以上，細胞漿呈深紅色，為(+++)。采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行非參數(shù)Kruskal—Wallis檢驗統(tǒng)計分析，取α=0.01，即P＜0.01時認為有統(tǒng)計學意義。 實驗結果: 一、Ⅰ-TAC和MDC在病

7、理性瘢痕組織中的定位 Ⅰ-TAC和MDC彌漫性分布于真皮內成纖維細胞，局部分布于表皮內角質形成細胞中，呈顆粒狀，突出定位于細胞漿內。 二、Ⅰ-TAC和MDC在成纖維細胞中的表達及對比 Ⅰ-TAC和MDC在A、B組中呈高表達，與C組比較其差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，但A、B組之間比較其差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 結論: Ⅰ-TAC和MDC可能通過趨化Th1/2淋巴細胞定向遷移引發(fā)一系