Smad1互作蛋白chmp1b的篩選及初步鑒定分析.pdf

1、Tgf-β生長(zhǎng)因子在肺發(fā)育過(guò)程中對(duì)胎兒及新生兒腫發(fā)育過(guò)程中肺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞外基質(zhì)的合成及肺組織損傷后的修復(fù)等過(guò)程都起著著重要的作用。BMPs是Tgf-β超家族中的一個(gè)重要組成部分，而Smad1是BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，BMP的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程始于對(duì)跨膜的BMPⅠ型和Ⅱ型受體的激活，激活的Ⅰ型受體對(duì)下游負(fù)責(zé)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的Smad1/5/8進(jìn)行磷酸化，此后Smad1/5/8再與胞內(nèi)的Smad4結(jié)合，并以復(fù)

2、合體的形式進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與特異性轉(zhuǎn)錄因子一起調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。而通過(guò)敲除小鼠肺上皮細(xì)胞中的BMP基因抑制其表達(dá)會(huì)造成胎鼠產(chǎn)前肺發(fā)育畸形等致死性結(jié)果。所以，針對(duì)這條重要的信號(hào)通路以及其中涉及的各種信號(hào)分子之間作用的探索近年來(lái)成為了肺發(fā)育與疾病領(lǐng)域中研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。
　　 發(fā)育過(guò)程中，小鼠胚胎肺上皮細(xì)胞中敲除Smad1會(huì)導(dǎo)致其分化過(guò)程受到影響，并會(huì)最終導(dǎo)致新生呼吸衰竭。而Smad1本身作為一種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子其作用的發(fā)揮需要互作蛋白的

3、協(xié)助。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)酵母雙雜交體系對(duì)E18.5天小鼠胚胎肺文庫(kù)中與Smad1可能存在相互作用的蛋白進(jìn)行篩選，并用多種方式對(duì)前期篩選出的chmp1b是否與Smad1在體內(nèi)及體外存在相互作用進(jìn)行初步確認(rèn)，同時(shí)檢查chmp1b其在不同發(fā)育階段肺內(nèi)的表達(dá)水平，為研究TGF-β信號(hào)通路對(duì)肺發(fā)育的影響探尋新的思路
　　 方法：
　　 1、酵母雙雜交文庫(kù)的建立
　　 2、Smad1誘餌載體的構(gòu)建
　　 3、Smad1酵

4、母互作蛋白的篩選
　　 4、chmp1b與Smad1不同結(jié)構(gòu)域的酵母體外小規(guī)模mating互作驗(yàn)證確認(rèn)
　　 5、pcmb1質(zhì)粒的構(gòu)建。
　　 6、chmp1與Smad1的細(xì)胞內(nèi)熒光共定位實(shí)驗(yàn)
　　 7、Halo-tag pull down驗(yàn)證chmp1b與Smad1的互作
　　 8、用Realtime PCR檢測(cè)不同發(fā)育階段肺組織chmp1b表達(dá)量水平
　　 結(jié)果：
　　 1、小

5、鼠E18.5酵母雙雜交文庫(kù)建立完成。
　　 2、構(gòu)建了Smad1誘餌載體并通過(guò)酵母互作蛋白篩選體系篩選出640個(gè)酵母克隆菌株
　　 3、通過(guò)體外小規(guī)模mating實(shí)驗(yàn)確認(rèn)酵母中chmp1b與Smad1的MH2區(qū)互作
　　 4、pcmb1質(zhì)粒的構(gòu)建成功。
　　 5、chmp1b與Smad1細(xì)胞內(nèi)熒光共聚焦實(shí)驗(yàn)顯示在胞核和胞漿中存在共定位
　　 6、Halo-tag pull down實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明ch