貝西滑刃線蟲效應因子AB-Gpero基因克隆及功能研究.pdf

1、植物寄生線蟲(Plant Parasitic Nematodes，Phytonematodes)是指寄生于植物的各組織中，影響植物正常生長發(fā)育，造成植物出現(xiàn)疾病癥狀的一類線蟲。它通過口針刺入植物細胞、分泌效應蛋白（Effector Protein），修改植物細胞、攝取營養(yǎng)物質以維持自身生長發(fā)育?？刂菩鞍妆磉_的效應因子(Effector)，廣泛純在于植物寄生線蟲中，在線蟲整個生長發(fā)育及侵染寄生中起到重要作用。深入研究線蟲效應因子功能，

2、了解線蟲與宿主植物間的作用機制，對如何防治線蟲侵染宿主植物，減少經(jīng)濟損失具有重要意義。目前，對線蟲效應因子研究已成為線蟲研究的熱點。本實驗以貝西滑刃線蟲(Aphelenchoides bessseyi Christie)為供試材料，從效應因子Ab-Gpero（貝西滑刃線蟲谷胱甘肽過氧化物酶基因）入手，利用RACE擴增法，克隆了貝西滑刃線蟲上的該基因，利用原位雜交技術定位基因，了解效應因子的功能位置，利用RNAi技術分析其功能，了解效應因

3、子在貝西滑刃線蟲繁殖、侵染方面的作用。為將來開展貝西滑刃線蟲生物防治工作提供新思路。
　　目的基因的克隆。提取貝西滑刃線蟲RNA，構建第一鏈cDNA，利用生物信息學篩選靶標基因的EST序列，設計特異性引物，通過PCR、測序及NCBI中Blast比對確定為所研究基因的部分序列（Ab-Gpero片段基因大小為408bp）。根據(jù)獲得的序列，設計新引物，用RACE法克隆目的基因cDNA全長序列，進行基因分析。
　　原位雜交分析Ab-

4、Gpero基因的表達位置。根據(jù)目的基因設計特異探針，利用原位雜交確定基因表達位置。結果顯示Ab-Gpero基因的表達位置在背食道腺上，分析了基因功能位點。
　　RNAi分析Ab-Gpero基因的功能。利用T7RNA聚合酶合成dsRNA，純化后將dsRNA侵泡導入供試貝西滑刃線蟲體內(nèi)，dsRNA量與線蟲樣量相當。24小時后，將dsRNA處理的線蟲和未經(jīng)dsRNA處理的線蟲轉接到胡蘿卜培養(yǎng)基上，觀察其對胡蘿卜愈傷組織的侵染狀況。發(fā)現(xiàn)d