番茄SlGRAS1基因的克隆及功能研究.pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factor，TFs）通常也也稱為反式作用因子，能夠與基因啟動子區(qū)域的順式作用元件特異性結(jié)合，激活或抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄表達，從而達到調(diào)控基因表達的目的。
　　GRAS蛋白家族作為高等植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，據(jù)報道在赤霉素信號通路、分生組織的維持和光敏色素信號通路等重要的生理過程以及植物抗逆過程中發(fā)揮重要的生理功能。該蛋白家族通常由400-770個氨基酸組成，羧基端高度保守，氨基端在序列長度和種類上

2、復雜多變，同時決定著蛋白獨有的功能。迄今為止，大部分GRAS蛋白家族成員的功能尚未報道。
　　本研究以番茄（Solanum lycopersicum）為材料，對GRAS家族成員SlGRAS1進行研究。首先從番茄基因組中克隆了SlGRAS1基因，分析了基因結(jié)構(gòu)、啟動子區(qū)域以及蛋白物理性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征，構(gòu)建了GRAS蛋白家族的系統(tǒng)發(fā)生樹；采用Real-time PCR方法研究了番茄SlGRAS1基因的時空表達模式以及非生物脅迫、外源激素

3、的響應情況；構(gòu)建了超表達載體和反義表達載體，通過農(nóng)桿菌介導番茄的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了相應的轉(zhuǎn)基因植株，并進行形態(tài)學觀察分析以及與成熟相關(guān)基因的表達量檢測。初步分析了番茄SlGRAS1基因在番茄生長發(fā)育過程中的生物學功能。本研究得到的主要結(jié)果如下：
　　一、運用生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，番茄SlGRAS1基因全長1629bp，編碼542個氨基酸，具有典型的GRAS家族特征；啟動子區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域具有許多功能元件，如光應答元件、逆境應答元件

4、和激素應答元件。
　　二、蛋白預測分析發(fā)現(xiàn)SlGRAS1蛋白的分子量和等電點分別為60.5KDa和5.52，預測可能為不穩(wěn)定的脂溶性親水蛋白，無信號肽和跨膜區(qū)域，因此不是分泌蛋白和膜蛋白。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)生樹分析，SlGRAS1屬于PAT1亞家族，與AtSCL13具有83％的氨基酸序列相似性。
　　三、該基因的組織特異性表達分析發(fā)現(xiàn)，番茄SlGRAS1基因在花和莖中表達量較高，在果實坐果到成熟過程中，SlGRAS1基因在坐果和破色

5、期表達量明顯高于其他時期。逆境脅迫響應中，低溫和高溫處理對SlGRAS1基因的表達影響較大，氧脅迫、滲透壓脅迫和鹽脅迫對基因表達影響相對較小。外源激素響應分析顯示，SlGRAS1基因的表達在轉(zhuǎn)錄水平上受到這些激素的調(diào)控，其中外源施加生長素（Indole-3-acetic acid，IAA）和乙烯使得SlGRAS1基因的表達水平顯著上調(diào)。
　　四、構(gòu)建超表達載體K303-35S-SlGRAS1-GFP和干擾抑制載體pCambia13

6、01-AsSlGRAS1，并通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)入番茄中獲得了超表達陽性植株，以野生型為對照，我們通過對T1代和T2代超表達轉(zhuǎn)基因植株進行了統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)SlGRAS1超表達植株具有株高變高，節(jié)間距伸長以及果實成熟推遲的表型。
　　五、對果實成熟周期延長的現(xiàn)象研究中，我們選取了超表達轉(zhuǎn)基因植株四個不同發(fā)育時期MG，Br，Br+4，Br+7的果實，提取RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時篩選了與成熟相關(guān)的重要的基因，通過Real-time PC