背根神經(jīng)節(jié)TRESK參與神經(jīng)病理性疼痛的作用研究.pdf

1、一、研究背景
　　 背根神經(jīng)節(jié)在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。許多研究證明背根神經(jīng)節(jié)的多種鉀離子通道亞型的變化是神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生、發(fā)展的必要條件。TRESK，編碼KCNK18基因，是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)雙孔鉀離子通道亞型，在背根神經(jīng)節(jié)中大量表達(dá)。其主要功能是維持神經(jīng)元細(xì)胞的靜息電位，在神經(jīng)元細(xì)胞興奮過(guò)程中起著重要作用。越來(lái)越多的研究證明了TRESK可能參與各型疼痛的發(fā)生過(guò)程，但目前并未有關(guān)于背根神經(jīng)節(jié)的TRESK參與神

2、經(jīng)病理性疼痛的研究。
　　 二、目的
　　 本研究首先觀察坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷誘發(fā)神經(jīng)病理性疼痛的大鼠模型中背根神經(jīng)節(jié)TRESKmRNA的變化。在成功構(gòu)建了TRESK基因重組腺病毒載體后，轉(zhuǎn)染背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞，驗(yàn)證其轉(zhuǎn)染和上調(diào)TRESKmRNA的效率，并研究TRESK基因上調(diào)對(duì)背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞P物質(zhì)釋放的影響。另外，對(duì)坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷誘發(fā)神經(jīng)病理性疼痛大鼠鞘內(nèi)注射TRESK基因重組腺病毒載體，驗(yàn)證其在體上調(diào)大鼠

3、背根神經(jīng)節(jié)TRESKmRNA和蛋白的效果，并觀察此變化對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠痛閾的影響以及對(duì)脊髓膠質(zhì)細(xì)胞激活程度的影響。探討背根神經(jīng)節(jié)的TRESK在神經(jīng)病理性疼痛中的作用。
　　 三、方法
　　 實(shí)驗(yàn)分四部分：
　　 1.雄性SD大鼠32只，隨機(jī)分為2組，假手術(shù)組（Shame組，n=16）和坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷組（SNI組，n=16）。兩組大鼠各取8只術(shù)前1d處死，取L4,5術(shù)側(cè)的DRG，realtime PCR

4、檢測(cè)TRESKmRNA表達(dá)；各組余下8只大鼠分別與術(shù)前1d及術(shù)后1、3、5、7、14d分別測(cè)定機(jī)械痛閾和熱痛閾，術(shù)后14d處死，realtime PCR檢測(cè)L4,5術(shù)側(cè)DRG的TRESKmRNA表達(dá)。
　　 2.從大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中克隆TRESK全長(zhǎng)cDNA，PCR鑒定及DNA測(cè)序驗(yàn)證；
　　 構(gòu)建以CMV啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的pAd/CMV/V5-DEST-TRESK。轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，挑取陽(yáng)性重組克隆行PCR鑒定、酶

5、切鑒定后，再取陽(yáng)性克隆后行DNA測(cè)序。將測(cè)序正確的質(zhì)粒經(jīng)PacI酶切線(xiàn)性化，轉(zhuǎn)染包裝293T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生TRESK基因重組的腺病毒載體，逐孔稀釋滴度法測(cè)定病毒滴度。
　　 3.原代培養(yǎng)大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，隨機(jī)分為6組，每組9孔。對(duì)照組(C組)：不行任何處理；辣椒素組（S組）：300nmol/L辣椒素的新鮮培養(yǎng)液孵育10min；陰性對(duì)照組(NC組)：每孔加入3×109個(gè)陰性對(duì)照腺病毒；陰性對(duì)照+辣椒素組(NCS組)：每孔加入3×

6、109陰性對(duì)照腺病毒，72h后，300nmol/L辣椒素的新鮮培養(yǎng)液孵育10min；TRESK基因重組腺病毒組（R組）：每孔中加入3×109個(gè)TRESK基因重組腺病毒pAd/CMV/V5-DEST-TRESK；TRESK基因重組腺病毒+辣椒素組(RS組)：每孔中加入3×109個(gè)TRESK基因重組腺病毒pAd/CMV/V5-DEST-TRESK，72h后，300nmol/L辣椒素的新鮮培養(yǎng)液孵育10min。
　　 各組于48h后采

7、用realtime PCR檢測(cè)TRESKmRNA表達(dá)；72h后分別用Westernblot法和放射免疫分析法檢測(cè)TRESK蛋白和SP的釋放。
　　 4.雄性SD大鼠108只，隨機(jī)分為6組(n=18)：Ⅰ組為空白對(duì)照組；Ⅱ組為假手術(shù)組；Ⅲ組制備坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷（SNI）大鼠模型；Ⅳ組制備SNI大鼠模型后再鞘內(nèi)注射生理鹽水；Ⅴ組制備SNI大鼠模型后再鞘內(nèi)注射陰性腺病毒；Ⅵ組制備SNI大鼠模型后再鞘內(nèi)注射TRESK基因重組腺病毒

8、pAd/CMV/V5-DEST-TRESK。
　　 各組分別與術(shù)前1d及術(shù)后1、3、5、7、14d分別測(cè)定機(jī)械痛閾和熱痛閾。術(shù)后14d處死，取L4,5術(shù)側(cè)DRG，每組6只realtime PCR檢測(cè)L4,5術(shù)側(cè)DRG的TRESKmRNA表達(dá)，再取6只檢測(cè)L4,5術(shù)側(cè)DRG的TRESK蛋白表達(dá)，剩余6只大鼠取L4,5脊髓，免疫組織化學(xué)觀察脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的激活程度。
　　 四、結(jié)果
　　 1.SNI組術(shù)后1～14d時(shí)的

9、機(jī)械痛閾明顯低于Shame組，SNI組術(shù)后14d術(shù)側(cè)L4,5DRG的TRESKmRNA表達(dá)明顯低于Shame組；與術(shù)前組內(nèi)比較，SNI組術(shù)后1～14d時(shí)的MWT明顯降低，SNI組術(shù)后14d術(shù)側(cè)L4,5DRG的TRESKmRNA表達(dá)明顯降低。
　　 2.從大鼠DRG細(xì)胞中克隆的TRESK全長(zhǎng)cDNA為781bp，DNA測(cè)序驗(yàn)證DNA序列與GeneBank中收錄的大鼠TRESK序列完全一致。以pAD-GFP空載體為對(duì)照，pAD/CM

10、V/V5-DEST-TRESK gDNA為模板的PCR擴(kuò)增，目的片段781bp，鑒定結(jié)果與預(yù)期相符。腺病毒滴度為1.31×109TU／m1。
　　 3.與C組比較，R組、RS組大鼠DRG細(xì)胞的TRESKmRNA表達(dá)水平均明顯升高，S組、NCS組大鼠DRG細(xì)胞的TRESKmRNA表達(dá)水平均明顯降低。與C組比較，R組、RS組大鼠DRG細(xì)胞的TRESK蛋白表達(dá)水平均明顯增高；S組、NCS組大鼠DRG細(xì)胞的TRESK蛋白表達(dá)水平均明顯降

11、低。與C組比較，S組、NCS組、RS組大鼠DRG細(xì)胞的SP水平均明顯增高；S組、NCS組大鼠DRG細(xì)胞的SP水平均明顯高于RS組。
　　 4.Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組術(shù)后1～14d時(shí)的機(jī)械痛閾明顯低于Ⅰ組，Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組5、7、14d時(shí)的機(jī)械痛閾明顯低于Ⅵ組；與術(shù)前比較，Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組術(shù)后1～14d時(shí)的機(jī)械痛閾明顯降低。Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組L4,5術(shù)側(cè)DRG的TRESKmRNA表達(dá)明顯低于Ⅰ組，Ⅵ組L4,5術(shù)側(cè)DRG的

12、TRESKmRNA表達(dá)明顯高于Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組。Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組L4,5術(shù)側(cè)DRG的TRESK蛋白表達(dá)明顯低于Ⅰ組，Ⅵ組L4,5術(shù)側(cè)DRG的TRESK蛋白表達(dá)明顯高于Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組。Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組脊髓膠質(zhì)細(xì)胞激活明顯高于Ⅰ組；Ⅵ組脊髓膠質(zhì)細(xì)胞激活明顯低于Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組。
　　 五、結(jié)論
　　 1.神經(jīng)病理性疼痛會(huì)導(dǎo)致背根神經(jīng)節(jié)的TRESKmRNA下調(diào)，神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生、發(fā)展可能與背根神經(jīng)節(jié)的TRES

13、K 密切相關(guān)。
　　 2.成功克隆了大鼠TRESK全長(zhǎng)cDNA，并構(gòu)建其重組腺病毒表達(dá)載體：pAD/CMV/V5-DEST-TRESK，腺病毒滴度為1.31×109TU／m1。
　　 3.TRESK基因重組腺病毒載體pAd/CMV/V5-DEST-TRESK可有效地上調(diào)大鼠原代背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞TRESKmRNA及其蛋白的表達(dá)；TRESK基因上調(diào)可抑制辣椒素誘發(fā)的大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞P物質(zhì)的釋放。
　　 4.鞘內(nèi)注射T