鵝細小病毒熒光定量PCR檢測方法的建立與應用及其VP3基因序列分析.pdf

1、鵝細小病毒(Goose parvovirus，GPV)是小鵝瘟的病原，可引起4～20日齡雛鵝的急性或亞急性敗血性感染，也能感染雛番鴨。其傳播速度快，發(fā)病率、死亡率都很高，給養(yǎng)鵝業(yè)帶來重大的經(jīng)濟損失。所以本試驗旨在建立一種快速、特異、準確的診斷GPV的熒光定量PCRfFluorescence Quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)方法，并用該方法對病毒在雛鵝體內(nèi)分布規(guī)律進行了較系統(tǒng)的研究，為指導臨床診斷樣品的采集保證診斷的可靠性

2、與準確性和對該病的診斷監(jiān)測提供了重要的試驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。此外，還分別將來自國內(nèi)的4個GPV毒株，通過PCR技術從病毒基因組DNA中擴增出病毒VP3完整基因片段進行克隆及序列比較，為鵝細小病毒感染的預防和疫苗的選擇提供了一定的理論依據(jù)。 本研究共分四部分： 一、GPV山東株的分離鑒定采取山東某鵝場發(fā)病典型的商品代鵝和本實驗室保存2002年病料的心臟、肝臟、腸道等組織臟器，制成乳劑；接種于12曰齡鵝胚尿囊腔，結果接種后72

3、～192 h內(nèi)，鵝胚死亡，死亡率95％，且鵝胚呈出血狀；接種3日齡雛鵝，結果表明試驗組雛鵝能夠表現(xiàn)出小鵝瘟臨床癥狀，而對照組正常；瓊脂擴散試驗結果顯示與鵝細小病毒標準株陽性血清有明顯沉淀線；參照GenBank GPV標準株B株結構蛋白VP1基因序列設計一對特異性引物，PCR反應擴增獲得目的條帶，克隆測序后，與GPV B株序列同源性達98％。綜合以上生物學和分子生物學的實驗結果，可確定分離到2株GPV，并命名為SI)2002株和SD200

4、5株。 二、LUX<'TM>引物熒光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCRFQ-PCR)檢測GPV方法的建立根據(jù)國際GeneBank 1995年發(fā)布的鵝細小病毒(GPV)B株的全基因組序列，針對GPV的保守基因片段VP1設計一對LUX<'TM>引物，建立了一種用于檢測GPV的特異的FQ-PCR方法，該法能夠特異地擴增出預期大小約為62bp特征性片段。特異性實驗證明，該法對鴨瘟病毒(DPV)、雛鵝新

5、型病毒性腸炎病毒(NGVEV)和正常鵝胚尿囊液及鵝組織DNA均呈陰性反應；靈敏性實驗證明，該方法能夠檢出GPV基因質(zhì)粒達10<'3>個拷貝數(shù)，檢測到的GPV病毒核酸最低量可以達到2.5pg。三、熒光定量PCR檢測雛鵝人工感染GPV后病毒在體內(nèi)分布規(guī)律用建立的FQ-PCR檢測鵝細小病毒的方法，檢測3日齡GPv抗體陰性雛鵝經(jīng)口服加滴鼻的方法人工感染GPV后，各器官不同時間段的病毒含量。結果表明：在攻毒8h后能從舌、各個腸段、糞、消化系統(tǒng)、血

6、液、心臟和肝臟中檢測到病毒DNA；病毒DNA的含量在．48h后達到最高峰并一直維持到168h，這段時間在每個待檢臟器中均能檢測到大量病毒DNA：隨后各待檢臟器中病毒DNA含量持續(xù)降低，但在720h后仍能從糞、肝臟和脾中檢測到少量的病毒DNA。本研究為指導臨床診斷樣品的采集保證診斷的可靠性和準確性以及對該病的診斷監(jiān)測提供了重要的試驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。 四、GPV不同毒株主要結構蛋白VP3基因的序列比較分析根據(jù)發(fā)表的GPV B株基因序

7、列合成了擴增GPV VP3基因的一對特異性引物。利用這對引物，分別將來自國內(nèi)的4個GPV毒株，通過PCR技術從病毒基因組DNA中擴增出病毒VP3完整基因片段，將其克隆、鑒定、測序。序列測定結果顯示4個GPV毒株的VP3基因全長均為1605bp，編碼534個氨基酸。氨基酸序列分析比較表明：4株GPV VP3基因氨基酸編碼序列非常保守，與其它參考毒株的同源性在96.4％～99.8％之間，其中，2株山東株之間的同源性為99.3％，與其它參考毒