宮頸癌Hela細胞中miR-21與PDCD4相互作用的研究.pdf

1、目的：應(yīng)用生物信息學方法和分子生物學技術(shù)，在宮頸癌Hela細胞中預測并驗證miR-21的相關(guān)靶基因，探討miR-21與靶基因的相互作用及其與宮頸癌發(fā)病的關(guān)系，為進一步研究宮頸癌發(fā)生的分子機制和宮頸癌基因治療方法提供新的思路和實驗依據(jù)。
　　 方法：⑴應(yīng)用生物信息學方法分析miR-21的染色體定位、保守性分析等，利用網(wǎng)絡(luò)共享軟件MicroCosm Targets、TargetScan和PicTar，分析其可能作用的靶基因。⑵用脂質(zhì)

2、體轉(zhuǎn)染的方法，將美國Ambion公司合成的pre-miR-21、pre-miRnegative control和anti-miR-21、anti-miR negative control瞬時轉(zhuǎn)染入Hela細胞中，實時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法檢測miR-21相對表達量。⑶蛋白免疫印跡方法(Western-blot)：提取細胞總蛋白，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、PDCD4抗體孵育，曝片顯影，利用軟件對PDCD4蛋白的相對含量進行分析。⑷熒光素

3、酶報告實驗：將PDCD4分子的3'UTR序列中miR-21結(jié)合位點上下游的部分片段導入pMIR-REPORT-luciferace熒光素酶報告基因載體，構(gòu)建重組載體(pMIR-Luc-PDCD4)，并進行酶切及測序鑒定。以重組載體(pMIR-Luc-PDCD4)、標準化對照載體(pMIR-REPORT-β-gal)與pre-miR-21或anti-miR-21共轉(zhuǎn)染Hela細胞(實驗組)，72小時后分別檢測Hela細胞的熒光素酶(Luc

4、)和β半乳糖苷酶的活性，計箅二者的比值(Luc/β-gal)。同時設(shè)立三個對照組(no miRNA空白對照組、pre-miR-negative對照組和anti-miR-negative對照組)，比較各組Luc/β-gal比值，驗證miR-21作用靶點的真實性。
　　 結(jié)果：①利用在線軟件PicTar、MicroCosm Targets和TargetScan預測miR-21的作用靶基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDCD4可能是miR-21作用的靶

5、基因。②Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pre-miR-21后，細胞中PDCD4蛋白的表達水平下調(diào)(P＜0.01)；轉(zhuǎn)染anti-miR-21后，細胞中PDCD4蛋白的表達水平上調(diào)(P＜0.05)。③利用pMIR-REPORT熒光素酶報告基因載體，經(jīng)酶切鑒定和測序驗證，成功構(gòu)建重組載體pMIR-Luc-PDCD4-3'UTR。pMIR-REPORT熒光素酶實驗結(jié)果表明，三個對照組(no miRNA空白對照組、pre-miR-neg

6、ative對照組和anti-miR-negative對照組)，Luc/β-gal比值接近。實驗組，pre-miR-21共轉(zhuǎn)染組，熒光素酶活性下降約43％(P＜0.001)；anti-miR-21共轉(zhuǎn)染組，熒光素酶活性升高約37％(P＜0.001)，表明PDCD4是miR-21的真實作用靶點。
　　 結(jié)論：⑴在宮頸癌Hela細胞中，miR-21調(diào)控抑癌基因PDCD4蛋白的表達，PDCD4是miR-21的重要靶基因。⑵miR-21在