水稻吸收和利用不同形態(tài)氮素的生理特征和相關基因的表達調控分析.pdf

1、水稻是中國乃至世界的主要糧食作物之一，而氮(N)是其生產的重要限制因子。水稻在淹水的條件下，以銨(NH<,4><'+>)作為主要的N源，但由于其根系的泌氧作用產生的根際硝化作用導致有相當數量的N以硝態(tài)氮(NO<,3><'->-N)的形式吸收。前人已有報道，NH<,4><'+>和NO<,3><'->混合營養(yǎng)更有利于水稻的生長和N肥的利用。因此，深入認識水稻吸收和利用NH<,4><'+>、NO<,3><'->的生理機制，特別是從分子水平鑒定

2、和分析調控NH<,4><'+>、NO<,3><'->吸收和利用相關基因的功能，將對水稻的生產和提高N肥利用率產生積極的作用。本論文以華東地區(qū)廣泛種植的粳稻品種“武運粳7?！睘楣┰嚻贩N，研究了N饑餓7天(d)后，恢復供應不同形態(tài)N源(NH<,4><'+>、NO<,3><'->、NH<,4><'+>NO<,3>)在0.5小時(h)到4 d對水稻N的吸收和積累及N還原同化中關鍵酶的生理差異和相關基因的調控，同時利用基因芯片對水稻恢復供應不同形

3、態(tài)N素4 d后所調控表達的基因進行了分析。另外，以粳稻模式種“日本晴(Nipponbare)”為材料，將基因啟動子與GUS報告基因融合，研究了水稻高親和力NO<,3><'->轉運系統(tǒng)的4個編碼基因(OsNRTT2；3、OsNRT2；4、OsNAR2；1和OsNAR2；2)的啟動子的時空表達特異性，以進一步推測它們的功能。主要研究結果如下： 1)通過水培試驗，研究了N饑餓7 d后，恢復供應不同形態(tài)N源對水稻(“武運粳7?！?N的吸

4、收和積累及N同化中關鍵酶活性的影響。結果表明，缺N刺激根系的生長，增加了根冠比，供應NH<,4><'+>營養(yǎng)抑制根系的生長，降低根冠比。與單一NO<,3><'->營養(yǎng)相比，供應NH<,4><'+>營養(yǎng)顯著地增加地上部生物量和體內的N積累。與單一NH<,4><'+>或NO<,3><'->營養(yǎng)相比，NH<,4>NO<,3>營養(yǎng)促進了水稻對N的吸收和轉運，葉片和根系中全N及葉片中NH<,4><'+>-N的含量以NH<,4>NO<,3>處理最高

5、，而且增強了根系的谷氨酰胺合成酶和葉片中硝酸還原酶的活性，提高了水稻同化和利用N的能力。另外，與單一NH<,4><'+>營養(yǎng)相比，供應單一NO<,3><'->或NH<,4>NO<,3>混合營養(yǎng)顯著增加了根系活力，從而提高了根系吸收N的能力。 2)利用半定量RTPCR分析水稻根系的NH<,4><'+>、NO<,3><'->吸收和還原同化相關基因在恢復供應不同形態(tài)N素的表達模式。水稻高親和力銨轉運蛋白編碼基因AMT1家屬中OsAMT

6、1;1是組成型表達，基本上不受N供應形態(tài)和狀態(tài)的影響：而在N饑餓脅迫下OsAMT1;2和OsAMT1;3的表達很弱，恢復供應2.5 mM的NH<,4><'+>和1.25 mM NH<,4>NO<,3>分別增強了OsAMT1;2和OsAMT1;3的表達，NO<,3><'->營養(yǎng)對OsAMT1;2的表達有明顯的抑制作用；單一供NH<,4><'+>或短時間供NO<,3><'->(恢復供應N 2h內)增強了OsAMT1;3表達。 說明O

7、sAMT1s基因不僅受NH<,4><'+>濃度的調控，而且也受NO<,3><'->或體內外NH<,4><'+>和NO<,3><'->平衡的影響。水稻高親和的硝酸鹽轉運蛋白編碼基因OsNRT2;3，在N饑餓時有較高的表達，而在高N供應時無論是單一NH<,4><'+>、單一NO<,3><'->還是NH<,4>NO<,3>營養(yǎng)均減弱其表達。在水稻N饑餓后供應NO<,3><'->營養(yǎng)(NO<,3><'->或NH<,4>NO<,3>)迅速誘導了硝

8、酸還原酶編碼基因OsNiR1的表達，其中供NH<,4>NO<,3>比供單一NO<,3><'->更能促使OsNiR1的強烈而穩(wěn)定的表達。相反，在氮同化中起重要作用的谷氨酰胺合成酶(GS酶)編碼基因OsGS1;1的表達幾乎不受N供應形態(tài)和缺N脅迫的影響。 3)利用包含水稻21，495寡核苷酸cDNA芯片(代表大約22，000個基因)，以NH<,4>NO<,3>營養(yǎng)的水稻根系和葉片樣品為對照，分析和鑒定了恢復供應NH<,4><'+>-

9、N、NO<,3><'->-N和繼續(xù)缺N 4 d后所調控的水稻的基因。結果表明，不同N營養(yǎng)處理下，根系比葉片響應更敏感。相比較NH<,4> NO<,3>營養(yǎng)，當恢復供應單一的NH<,4><'+>、NO<,3><'->，在根系顯著被調控達2倍以上的基因分別是445和324個，而地上部僅分別為32和58個。這些受調控的基因不僅包含了可能直接參與N的吸收和代謝途徑的基因，而且與葉綠素代謝及碳的固定和代謝密切相關。通過對這些被顯著調控的基因上游5

10、00bp的啟動子區(qū)域中順式調控元件分析，鑒定到可能分別與NH<,4><'+>、NO<,3><'->特異誘導的上游調控基因相結合的順式調控元件分別是6個和8個。其中ARECOREZMGAPC4的順式調控元件是包含在幾乎所有的NO<,3><'->特異性誘導表達基因的啟動子區(qū)，生物信息學分析表明它可能是MYB類型轉錄因子的結合位點。另外，鑒定到受單一NH<,4><'+>、單一NO<,3><'->或N饑餓脅迫顯著(2倍以上)響應的水稻18個轉錄

11、因子基因，其中在根系表達的有16個，而在地上部表達的僅有2個。 4)將編碼水稻高親和硝酸鹽轉運蛋白基因的啟動子片段與GUS報告基因相融合，再轉入到水稻模式種“日本晴”的中，通過檢測GUS報告基因的表達，分析了OsNRT2;3、OsNRT2；4、OsNAR2；1和OsNAR2；2的時空表達特異性和它們可能的生理功能。OsNRT2；3在根的中柱和葉脈表達，其功能可能不是主要承擔對外部介質中NO<,3><'->的吸收，而是負責在體內對