胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素在口腔扁平苔蘚發(fā)病中的免疫機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：
　　口腔扁平苔蘚(Oral Lichen Planus，OLP)是最常見(jiàn)的口腔粘膜病之一，目前病因不明，無(wú)特異有效的治療方法，病程遷延，反復(fù)發(fā)作，且具有一定的惡變傾向，是口腔臨床醫(yī)師面臨的一大難題。該疾病的發(fā)病與精神、內(nèi)分泌、免疫、感染等多種因素相關(guān)，其中目前一致認(rèn)為免疫因素是最重要的病因。大量的研究表明OLP固有層內(nèi)是以T細(xì)胞為主的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，且上皮內(nèi)和鄰近病變基底膜的角質(zhì)細(xì)胞多數(shù)為激活的CD8+T淋巴細(xì)胞，提示

2、CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是OLP發(fā)病的主要因素。但其中具體的分子機(jī)制尚不明確。
　　胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(Thymic Stromal Lymphopoietin，TSLP)是一種最近發(fā)現(xiàn)的與CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答密切相關(guān)的細(xì)胞因子。研究表明TSLP主要由上皮細(xì)胞產(chǎn)生，是體外誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞激活并發(fā)揮細(xì)胞毒性的一個(gè)重要因子。TSLP能直接或者通過(guò)活化樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendric Cells，DCs)間接作用于CD8+T

3、細(xì)胞，不僅能維持其穩(wěn)定增殖，還能使CDS+T細(xì)胞分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，產(chǎn)生大量的IFN-γ，發(fā)揮細(xì)胞毒性作用。目前研究發(fā)現(xiàn)TSLP在多種如過(guò)敏性皮炎、哮喘等自身免疫性疾病中異常表達(dá)，且通過(guò)調(diào)控T細(xì)胞免疫功能影響疾病的發(fā)生發(fā)展，但其中具體的調(diào)控機(jī)制不明，尚需進(jìn)一步研究明確。
　　我們推測(cè)TSLP可能在OLP的免疫病理機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，并可能通過(guò)與CD8+T細(xì)胞的相互作用，影響著OLP疾病的發(fā)生和發(fā)展。為了深入研究TSLP在OLP

4、發(fā)病中作用及其機(jī)制，我們一方面通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)OLP組織切片和患者外周血清進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，觀察TSLP及其受體在口腔扁平苔蘚組織和血清中的表達(dá)規(guī)律;另一方面通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究TSLP與CD8+T細(xì)胞之間是否存在相互作用。此實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果不僅對(duì)OLP的免疫病因機(jī)制提供了分子學(xué)基礎(chǔ)，還將為未來(lái)OLP的免疫治療提供新的理論依據(jù)。
　　材料和方法：
　　第一部分
　　1.我們隨機(jī)選取了35例病理確診為OLP的患者粘膜標(biāo)本進(jìn)行組織染色

5、，同時(shí)以11例健康志愿者的正常粘膜標(biāo)本作對(duì)照;另收集了36例OLP患者血清進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，同時(shí)以35例健康志愿者血清作為對(duì)照。
　　2.用免疫組織化學(xué)的方法分別檢測(cè)OLP組織及健康對(duì)照組織粘膜標(biāo)本TSLP及其受體(TSLPR)的原位表達(dá)，并進(jìn)一步利用免疫熒光雙染技術(shù)檢測(cè)OLP固有層內(nèi)CD8+T細(xì)胞表面TSLPR的表達(dá)規(guī)律。
　　3.利用ELISA檢測(cè)OLP患者及健康對(duì)照外周血提取的血清中TSLP的分泌情況。
　　第二部

6、分
　　1.體外中性蛋白酶/膠原酶/胰蛋白酶聯(lián)合消化法分離正?？谇徽衬そ琴|(zhì)細(xì)胞，用含生長(zhǎng)因子的OKM培養(yǎng)基進(jìn)行原代及傳代培養(yǎng)，并利用角蛋白抗體行細(xì)胞免疫化學(xué)染色鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的上皮性來(lái)源。
　　2.取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代口腔角質(zhì)細(xì)胞按適當(dāng)密度接種于六孔板中，分別加入100ng/ml的炎癥細(xì)胞因子rhIL-4、rhTNF-α和rhIFN-γ，分別作用0、6h、9h、12h、24h、48h、72h，并在不同時(shí)間點(diǎn)分別提取各組口腔角

7、質(zhì)細(xì)胞的蛋白和mRNA，利用Western blot和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分別檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)角質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)合成TSLP蛋白和mRNA的情況。同時(shí)利用ELISA檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清內(nèi)TSLP的表達(dá)情況，找尋影響口腔角質(zhì)細(xì)胞合成和分泌TSLP的敏感刺激因素。
　　第三部分
　　1.體外Ficoll密度梯度離心法分選外周血單個(gè)核細(xì)胞(PMBC)，利用CD3和CD8免疫磁珠經(jīng)過(guò)兩次陽(yáng)性選擇分離原代CD8+CD3+細(xì)胞（即CD

8、8+T細(xì)胞），流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞純度。
　　2.將分選的原代CD8+T細(xì)胞體外以anti-CD3mAb和anti-CD28 mAb誘導(dǎo)活化，加入rhTSLP作用72小時(shí)，與口腔角質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)研究其殺傷效應(yīng)。同時(shí)設(shè)立rhTSLP刺激未活化CDS+T細(xì)胞組、CD3/CD28刺激組以及無(wú)刺激的medium組作為對(duì)照。檢測(cè)前徹底沖洗去除懸浮生長(zhǎng)的CD8+T細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下觀察各組口腔角質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)改變，通過(guò)MTT法檢測(cè)尋找能

9、夠誘發(fā)CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生殺傷功能的最佳效靶比例，利用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)與CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)的各組口腔角質(zhì)細(xì)胞的早期凋亡。通過(guò)檢測(cè)口腔角質(zhì)細(xì)胞的早期凋亡間接反應(yīng)rhTSLP對(duì)于活化CD8+T細(xì)胞殺傷角質(zhì)細(xì)胞的影響。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　1.TSLP在OLP患者口腔粘膜上皮中的表達(dá)(67％±31.65％)明顯高于健康對(duì)照組(8％±3.78％)(P＜0.05)，主要表達(dá)于異

10、常增殖的角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜上;而且基底層角質(zhì)細(xì)胞中TSLP的表達(dá)與固有層內(nèi)浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞的數(shù)量呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)關(guān)系;固有層內(nèi)大量的淋巴細(xì)胞表達(dá)TSLPR(45％±23.56％)，且約10％的TSLPR+細(xì)胞表達(dá)于CD8+T細(xì)胞上。
　　2.外周血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果示OLP患者中的TSLP表達(dá)水平(7.61±2.60 pg/ml)明顯高于正常健康人(0.21±0.13 pg/ml);但兩種臨床類(lèi)型的OLP患者的血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

11、(P＞0.05)。
　　第二部分
　　1.體外利用酶消化法成功分離并培養(yǎng)了口腔角質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)角蛋白染色鑒定，＞95％的細(xì)胞表達(dá)角蛋白陽(yáng)性，證明其上皮性來(lái)源及細(xì)胞純度。
　　2.口腔角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TSLP的蛋白水平在rhIFN-γ作用組隨時(shí)間呈現(xiàn)先降后升的動(dòng)態(tài)變化。在作用48小時(shí)前細(xì)胞內(nèi)TSLP的蛋白水平明顯降低，作用72h明顯回升接近正常水平;而rhIL-4作用組、rhTNF-α作用組口腔角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的TSLP的蛋白水平持續(xù)降

12、低。各組口腔角質(zhì)細(xì)胞TSLP mRNA水平的變化趨勢(shì)與蛋白水平基本一致，但在rhIFN-γ組，口腔角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的TSLP mRNA的變化明顯早于蛋白水平，在48小時(shí)即接近正常水平，到作用72小時(shí)其mRNA水平明顯增高，達(dá)到正常組的2.32倍。
　　3.口腔角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中TSLP的表達(dá)水平僅在rhIFN-γ作用72小時(shí)檢測(cè)到，為10.74±5.32 pg/ml;而rhIL-4作用組和rhTNF-α作用組均沒(méi)有檢測(cè)到TSLP的分泌。

13、
　　第三部分
　　1.利用Ficoll密度梯度離心法和免疫磁珠分選技術(shù)從外周血成功分離原代CD8+T淋巴細(xì)胞，經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞純度達(dá)到96％以上。
　　2.效靶比（CD8+T細(xì)胞:口腔角質(zhì)細(xì)胞）為10∶1時(shí)CD8+T細(xì)胞的殺傷效果最明顯。
　　3.形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，與CD3/CD28誘導(dǎo)活化的CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)的口腔角質(zhì)細(xì)胞均出現(xiàn)明顯的凋亡征象，加入rhTSLP后發(fā)生凋亡的口腔角質(zhì)細(xì)胞明顯增多;無(wú)刺激med

14、ium對(duì)照組和rhTSLP刺激的未活化CD8+T細(xì)胞組均未發(fā)現(xiàn)明顯的凋亡征象。
　　4.細(xì)胞凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)rhTSLP能明顯刺激CD3/CD28活化CD8+T細(xì)胞組中口腔角質(zhì)細(xì)胞的早期凋亡(39.2％±8.58％)，明顯高于其他各組(P＜0.01);而rhTSLP刺激未活化CD8+T細(xì)胞組(13.2％±2.41％)與無(wú)刺激的Medium對(duì)照組(10.2％±3.36％)中口腔角質(zhì)細(xì)胞的早期凋亡率沒(méi)有明顯差異(P＞0.05)。
　

15、　結(jié)論：
　　1.本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了TSLP在OLP病變粘膜組織和外周血清中的異常表達(dá);而且TSLP在OLP上皮中表達(dá)與固有層內(nèi)浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞的數(shù)量呈明顯正相關(guān)關(guān)系，提示TSLP在OLP的免疫病理機(jī)制中起著重要作用。
　　2.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)rhIFN-γ是影響口腔角質(zhì)細(xì)胞合成TSLP和分泌TSLP的主要炎癥細(xì)胞因子。提示在OLP發(fā)病過(guò)程中，固有層內(nèi)活化的T淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ為主的細(xì)胞因子能促進(jìn)與其鄰近的基底層角質(zhì)細(xì)胞對(duì)TSL

16、P的合成和分泌，并可以解釋第一部分免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)的“基底層角質(zhì)細(xì)胞中TSLP的表達(dá)與固有層內(nèi)浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞的數(shù)量呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)關(guān)系”。
　　3.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明rhTSLP能促進(jìn)CD3/CD28活化的CD8+T淋巴細(xì)胞對(duì)口腔角質(zhì)細(xì)胞的殺傷作用，而對(duì)未活化的CD8+T細(xì)胞沒(méi)有直接作用。提示在OLP中，IFN-γ誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞異常分泌的TSLP可能會(huì)作用于與其鄰近的固有層內(nèi)活化的CD8+T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)其對(duì)鄰近基底膜角質(zhì)細(xì)胞的殺傷作用