α1Na,K-ATPase和PDCD5在C57BL-6J小鼠耳蝸的年齡相關性表達及其與AHL的關系.pdf

1、第一部分成年小鼠耳蝸血管紋緣細胞的原代分離培養(yǎng)及鑒定
　　目的：建立成年小鼠耳蝸血管紋邊緣細胞(marginal cell，MC)的體外培養(yǎng)及鑒定方法，為進一步研究成年期MC的生理功能提供實驗細胞。
　　方法：顯微分離成年期小鼠耳蝸血管紋組織,以Ⅱ型膠原酶消化原代培養(yǎng)邊緣細胞,將其接種于六孔板中貼壁生長，加入含有15％胎牛血清、表皮生長因子、氫化可的松、胰島素、三碘甲狀腺原氨酸等促進細胞生長的完全培養(yǎng)基，在5％CO2/95％

2、空氣的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細胞生長情況，換液一周兩次或培養(yǎng)基顏色變渾濁。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，噻唑藍(MTT)法測細胞的生長曲線,透射電鏡觀察細胞的超微結構，免疫熒光法檢測上皮細胞的標志物-中間絲角蛋白18（CK18）和耳蝸血管紋的獨特標志物KCNQ1的表達，RT-PCR檢測CK18和KCNQ1mRNA的表達。
　　結果：倒置顯微鏡下可見接種24～48h后細胞貼壁增殖,形成大小不等的細胞島，一周后，細胞迅速生長，相

3、互融合,緊密連接，形成單層極性上皮層,呈典型的“鋪路石”樣外觀。透射電鏡觀察可見多角形細胞表面有較多微絨毛,胞漿內線粒體、內質網(wǎng)等細胞器豐富。免疫熒光細胞化學技術檢測顯示CK18和KCNQ1蛋白表達陽性，RT-PCR結果示CK18和KCNQ1的mRNA均有表達。
　　結論：采用原代消化培養(yǎng)技術，成功建立成年小鼠耳蝸血管紋MC的體外原代培養(yǎng)，為進一步研究成年期MC的功能和某些內耳疾病的發(fā)病機制提供了實驗細胞基礎。
　　第二部分

4、α1Na,K-ATPase通道蛋白在C57BL/6J小鼠耳蝸的年齡相關性表達及其與AHL的關系
　　目的：研究α1Na，K-ATPase離子轉運蛋白在不同年齡段C57BL/6J（C57）小鼠耳蝸血管紋的表達及其意義。
　　方法：選擇3M,6M,9M,12M月齡C57J小鼠各12只，采用聽性腦干反應（Auditory Brainstem Response，ABR）分別檢測其聽力變化。采用免疫組織熒光法和免疫印跡雜交Wester

5、n blot（WB）檢測α1Na,K-ATPase蛋白在小鼠耳蝸的表達變化，逆轉錄聚合酶鏈反應法（RT-PCR）檢測各年齡段小鼠耳蝸α1Na,K-ATPase mRNA在不同鼠齡小鼠耳蝸中的表達水平。
　　結果：隨著鼠齡的增長，C57小鼠各頻率ABR閾值逐漸升高，自6月齡小鼠的ABR反應閾逐漸增加，其數(shù)值與低齡組小鼠相比其差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。免疫熒光檢測顯示α1Na,K-ATPase主要分布于血管紋底側膜和螺旋韌

6、帶，表達量也隨著鼠齡的增加呈現(xiàn)減少的趨勢，Real-Time PCR檢測顯示α1Na,K-ATPase mRNA隨著小鼠年齡的增長其表達逐漸下調，與其蛋白變化趨勢相一致。
　　結論：C57小鼠耳蝸α1Na,K-ATPase的表達隨著年齡的增加而逐漸下降，可能與年齡相關性聽力損失具有一定聯(lián)系。
　　第三部分α1Na,K-ATPas通道蛋白在成年C57BL/6J小鼠血管紋邊緣細胞的表達和意義
　　目的：初步研究α1Na,K

7、-ATPase在血管紋緣細胞的表達和意義，為進一步探索耳蝸K＋循環(huán)提供實驗研究基礎。
　　方法：采用膠原酶消化法體外分離培養(yǎng)成年小鼠耳蝸血管紋邊緣細胞。采用免疫組織熒光法檢測α1Na,K-ATPase在血管紋邊緣細胞的表達和分布，并運用RT-PCR檢測α1Na,K-ATPase mRNA在邊緣細胞的表達情況。
　　結果：體外成功培養(yǎng)和純化了血管紋邊緣細胞，免疫熒光檢測可見有α1Na,K-ATPase陽性表達，主要位于細胞膜，

8、RT-PCR也檢測到α1Na,K-ATPase mRNA的表達。
　　結論：α1Na,K-ATPase在血管紋緣細胞表達，可能參與了耳蝸K＋循環(huán)形成，在維持正常耳蝸聽力中起重要作用。
　　第四部分凋亡相關蛋白PDCD5在C57BL/6J小鼠耳蝸毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的年齡相關性表達及與老年性的關系
　　目的：研究PDCD5和caspase-3在不同年齡段C57BL/6J（C57）小鼠耳蝸毛細胞、血管紋及螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的

9、表達，初步探討其在年齡相關性聽力下降發(fā)生、發(fā)展中的作用。
　　方法：選擇C57小鼠3M,6M,9M,12M月齡段各15只，分為四組。對各組小鼠雙側click、6、8 kHz ABR閾值檢測。采用免疫組織化學法和Western blotting（WB）檢測各月齡段小鼠耳蝸PDCD5和caspase-3蛋白的表達，實時熒光定量PCR（Real-Time PCR）檢測各月齡段小鼠耳蝸PDCD5和Caspase-3基因mRNA的表達變化。

10、
　　結果：隨著年齡的增長，C57小鼠各頻率ABR閾值逐漸提高，耳蝸PDCD5和caspase-3蛋白的表達亦逐漸增強。3月齡和6月齡小鼠耳蝸毛細胞和血管紋細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細胞僅出現(xiàn)少量PDCD5和caspase-3蛋白表達，9月齡時表達有明顯增加，至12月齡時表達最強，各組間相比有顯著性差異(P＜0.05)。Real-Time PCR檢測顯示PDCD5和Caspase-3基因mRNA隨著小鼠年齡的增長其表達逐漸增強，與其蛋白變化