脂肪間充質(zhì)干細胞向血管內(nèi)皮細胞分化過程中的miRNA差異性表達的模式分析.pdf

1、目的:
　　本研究課題旨從脂肪間充質(zhì)干細胞(ADSC)向血管內(nèi)皮細胞分化的角度入手,通過應(yīng)用miRNA微列陣及 qRT-PCR對分化過程中差異性表達的miRNA進行篩選及證實,從而對這些miRNA的目的基因和所參與的細胞信號通路進行推測與分析。
　　方法:
　　1對hADSC傳代、培養(yǎng),應(yīng)用ADSC定向血管內(nèi)皮細胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。
　　2對誘導(dǎo)分化前后的ADSC及血管內(nèi)皮細胞進行流式檢測表面抗原標記,應(yīng)

2、用顯微光鏡和透射電鏡對誘導(dǎo)前后細胞的組織學(xué)形態(tài)進行觀察,比較,以保證試驗數(shù)據(jù)可靠。
　　3對誘導(dǎo)前的ASDCs及誘導(dǎo)后形成的血管內(nèi)皮細胞進行 miRNA的提取,然后對誘導(dǎo)前后細胞的差異性表達miRNA進行miRNA微陣列分析
　　4根據(jù) miRNA微列陣的分析結(jié)果,選取誘導(dǎo)前后差異性表達倍數(shù)較高的miRNA,對其進行qRT-PCR驗證,以近一步明確其差異性表達。
　　5應(yīng)用生物信息學(xué)軟件David6.7對miRNA微列

3、陣篩查出的差異性表達miRNA進行GO、Pathway分析;
　　6通過使用TargetScan,Miranda,PITA,RNAhybrid,及microTar等五個miRNA數(shù)據(jù)庫,對miRNA微列陣和qRT-PCR分析同時篩查出的差異性表達miRNA進行靶基因預(yù)測,選出在三個以上(包括三個)數(shù)據(jù)庫內(nèi)重復(fù)出現(xiàn)的miRNA的預(yù)測靶基因,整理成表,以供進一步分析。
　　結(jié)果:
　　1流式鑒定:
　　誘導(dǎo)前hADS

4、C細胞CD31、HLA-DR呈陰性表達;CD44、CD105呈陽性表達;誘導(dǎo)后CD44、HLA-DR呈陰性表達,CD31呈陽性表達,CD105呈弱陽性表達。
　　2光鏡及透射電鏡細胞組織學(xué)分析:
　　光鏡:細胞誘導(dǎo)前呈長梭形,渦旋狀排列;誘導(dǎo)后細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,梭形變短,大部分細胞呈橢圓形。
　　電鏡:人脂肪間充質(zhì)干細胞-誘導(dǎo)前:胞內(nèi)無 W-P小體;人脂肪間充質(zhì)干細胞-誘導(dǎo)成血管內(nèi)皮細胞后:胞漿內(nèi)可見血管內(nèi)皮細胞特

5、有的電子密度較高的W-P小體,胞漿內(nèi)可見血管內(nèi)皮細胞具有的吞飲小泡。
　　3 miRNA微陣列分析及qRT-PCR驗證:
　　miRNA微列陣:P值〈0.05,30種miRNA在誘導(dǎo)分化前后表達差異性顯著:其中16種分化后較分化前表達上調(diào),而14種則表達下調(diào)。
　　qRT-PCR:從miRNA微列陣的分析結(jié)果中選取6種分化前后差異性表達倍數(shù)較高的miRNA,驗證出四種顯著的差異性表達的miRNA,其中包括分化后較分化前

6、表達上調(diào)的has-miR-29b-3p,has-miR-5096;表達下調(diào)的has-miR-143-3p,has-miR145-5p。
　　4差異性表達miRNA的靶基因預(yù)測及pathway分析:
　　差異性表達miRNA的靶基因所參與的大部分細胞信號途徑腫瘤細胞形成的細胞信號通路相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1 ADSC在定向分化為血管內(nèi)皮細胞的過程中存在差異性表達的miRNA,其差異性表達方式為上調(diào)或下調(diào)。