microRNA對(duì)hERG基因表達(dá)影響的研究.pdf

1、背景與目的：惡性室性心律失常是導(dǎo)致心源性猝死( SCD)的主要原因，但因其誘發(fā)因素繁多、發(fā)病機(jī)制不詳，難以得到有效的預(yù)防及治療。其中臨床常見(jiàn)的獲得性長(zhǎng) Q T綜合征( aLQTS)致尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過(guò)速( TdP)是導(dǎo)致 S C D的重要原因之一。大量研究證實(shí)，阻滯 hERG（即 KCNH2）基因所編碼的快速激活延遲整流鉀電流（IKr）通道時(shí)，可引起外向鉀電流減少，使心肌細(xì)胞復(fù)極延長(zhǎng)，易產(chǎn)生 TdP。近年來(lái)，有研究表明，微小 RNA(

2、miRNA)表達(dá)水平異常，可引起離子通道蛋白表達(dá)紊亂，導(dǎo)致離子通道失衡，誘發(fā)心律失常。本研究組前期已通過(guò)雙熒光素酶基因報(bào)告法從最初預(yù)測(cè)的6個(gè)miRNA（miR-134、miR-143、miR-103、miR-147、miR-185、miR-3619）中，初步篩選出4個(gè)與hERG基因有相關(guān)性（miR-134、miR-143、miR-103、miR-3619）。本實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步驗(yàn)證所篩選miRNA與hERG基因的相關(guān)性，并以 hERG基因?yàn)?/p>

3、靶點(diǎn)，探討 miRNA對(duì)其功能的影響，為aLQTS發(fā)生機(jī)制的研究提供新的思路。
　　方法：1.將 WT-hERG轉(zhuǎn)染至 U2OS細(xì)胞中，用濃度為400μg/ml G418篩選出穩(wěn)定表達(dá) WT-hERG的單克隆細(xì)胞；2.用miRNA及其相應(yīng)的反義寡核苷酸序列（AMOs）對(duì) hERG-U2OS細(xì)胞模型進(jìn)行干預(yù)；3. RT-PCR檢測(cè) miRNA對(duì) hERG基因相關(guān) mRNA表達(dá)的影響，western blot檢測(cè) miRNA對(duì) hER

4、G基因相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，激光共聚焦檢測(cè) miRNA對(duì) hERG基因相關(guān)蛋白質(zhì)定位的影響。結(jié)果：Western blotting結(jié)果顯示，用400μg/ml G418篩選出的轉(zhuǎn)染 WT-hERG的U2OS細(xì)胞，可見(jiàn)兩條明顯的蛋白質(zhì)條帶，分別表示 hERG基因所表達(dá)的滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的不成熟核心糖基化蛋白（135kD蛋白質(zhì)條帶）和位于細(xì)胞膜上、完全成熟的糖基化蛋白（155kD蛋白質(zhì)條帶），表明 hERG-U2OS穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建成功。分

5、子生物學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1. RT-PCR結(jié)果顯示：miR-134、miR-143、miR-103、miR-3619過(guò)表達(dá)可使hERG相關(guān) mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組下調(diào)；用相應(yīng)的AMOs拮抗miRNAs，hERG相關(guān) mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組無(wú)明顯變化；miR-147、miR-185作用下 hERG相關(guān) mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組無(wú)明顯改變；
　　2. Western blot結(jié)果顯示：miR-134、miR-1

6、43、miR-103、miR-3619過(guò)表達(dá)可使 hERG相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)較對(duì)照組下調(diào)；用相應(yīng)的AMOs拮抗miRNAs，hERG相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)較對(duì)照組無(wú)明顯變化；miR-147、miR-185作用下 hERG相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)較對(duì)照組無(wú)明顯改變；
　　3.激光共聚焦結(jié)果顯示：miR-134、143、103、3619過(guò)表達(dá)可使 hERG-U2OS細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)未成熟蛋白及細(xì)胞膜上成熟通道蛋白的表達(dá)較對(duì)照組均降低，用相應(yīng)的AMOs沉默 miR