水稻谷蛋白合成途徑關(guān)鍵基因的圖位克隆與功能研究.pdf

1、水稻種子在胚乳中積累大量的儲藏蛋白，約占籽粒干重的6-10％，其中谷蛋白占80％左右，貯存于PBⅡ中，任何對谷蛋白含量和組成的改變都會引起稻米品質(zhì)的變化。雖然幾乎所有的谷蛋白基因已經(jīng)得到克隆，但人們對谷蛋白的表達(dá)調(diào)控及谷蛋白的合成、轉(zhuǎn)運和沉積等過程尚缺乏足夠的了解。利用突變體結(jié)合圖位克隆技術(shù)是解決上述問題的捷徑。我們通過對9000多份資源的篩選獲得了17份谷蛋白突變體，對其中的低谷蛋白突變體W3660進(jìn)行了精細(xì)定位，并將緊密連鎖的分子標(biāo)

2、記應(yīng)用于輔助選擇育種；圖位克隆了谷蛋白前體劇增突變體W379的突變基因，并對其突變的機理進(jìn)行了深入的探討；圖位克隆了谷蛋白前體部分增加突變體Q4041的突變基因，并對該突變體進(jìn)行了基因芯片的研究。研究結(jié)果如下：
　　 1谷蛋白突變體的篩選
　　 利用SDS-PAGE技術(shù)從地方品種、T-DNA插入系和輻射誘變突變體中篩選獲得了17份突變體材料，突變頻率僅0.189％，分為3種類型：低谷蛋白突變體，共8份，其特點是谷蛋白成熟

3、的酸性和堿性亞基大量減少，球蛋白和醇溶蛋白含量大量增加。該類型的突變體可以用作培育適合腎臟病人和糖尿病人食用的低谷蛋白水稻品種，同時還可以用來分離谷蛋白表達(dá)調(diào)控相關(guān)基因；谷蛋白前體增加突變體（57H），共7份，表現(xiàn)為谷蛋白57kD前體不同程度的增加，酸性和堿性亞基相應(yīng)減少，該突變體可以用來克隆谷蛋白轉(zhuǎn)運、沉積途徑中的關(guān)鍵基因；球蛋白缺失體，共2份，該類型突變體有可能是球蛋白基因的突變，亦可能是其關(guān)鍵的調(diào)控基因的突變，同時聚合球蛋白缺失性

4、狀和低谷蛋白性狀將有助于培育可溶性蛋白含量更低的水稻品種。
　　 2 W3660突變基因的精細(xì)定位與分子標(biāo)記輔助選擇
　　 利用粳稻品種W3660與秈稻品種驚人糯雜交構(gòu)建的F2群體及其衍生群體對控制W3660低谷蛋白性狀的基因進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示：突變性狀受顯性單基因控制。采用SSR標(biāo)記技術(shù)，將該基因定位于第2染色體標(biāo)記SSR2-001/SSR2-004和RM1358之間，距SSR2-001/SSR2-004和RM135

5、8的遺傳距離分別為1.1cM和3.8cM。雖然W3660的突變基因與Lgc-1位于同一個定位區(qū)間，但二者是不同的突變體。我們分析了與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記在W3660與7個粳稻品種之間的多態(tài)性，將存在多態(tài)的SSR2-004和RM1358用于分子標(biāo)記輔助選擇，并計算獲得兩個標(biāo)記在粳/粳交組合中輔助選擇的效率分別為96.8％和92.7％，而采用雙標(biāo)記進(jìn)行選擇的效率則高達(dá)99.8％，從而為突變基因的分子標(biāo)記輔助育種奠定了基礎(chǔ)。
　　

6、 3 W379突變基因的克隆及其功能研究
　　 利用W379/培矮64//W379 BC1F1群體和W379/培矮64 F2群體，判定W379谷蛋前體劇增性狀受一對隱性核基因的控制，并將突變基因精細(xì)定位于第4染色體標(biāo)記RM4-001和IN4-001間，兩側(cè)標(biāo)記同位于BAC克隆OSJNBa0091D06中，中間的物理距離約30kb，利用生物信息學(xué)的方法，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在一個液泡加工酶基因，并命名為osVpe1，采用RT-PCR的方

7、法獲得了該基因的編碼區(qū)，序列比對后發(fā)現(xiàn)，突變體和野生型間只有一個核苷酸的差異，導(dǎo)致了W379中osVPE1蛋白的269位由Cys突變?yōu)镚ly。酶活性測定顯示，W379發(fā)育胚乳中Asn特異剪切活性不到日本晴中的10％，功能互補試驗證實了osVpe1就是目的基因。半定量RT-PcR分析表明，osVpe1的表達(dá)模式和表達(dá)水平在日本晴和W379間無顯著差異，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示突變的蛋白亦分選進(jìn)入液泡中。體外表達(dá)并純化了osvPE1片段，制備了多

8、克隆抗體，采用粗酶提取液提取蛋白進(jìn)行的Western雜交顯示，W379胚乳中的osVPE1（C269G）大都以前體的形式存在，而日本晴胚乳中則存在成熟的蛋白形式；而采用總蛋白提取液提取蛋白進(jìn)行的Western雜交顯示，W379中的VPE成熟蛋白分子量小于日本晴中的正常蛋白，暗示osVPE1（C269G）成熟時的剪切發(fā)生了錯誤，導(dǎo)致其功能的喪失。同時，突變體和野生型中的蛋白在體外溫浴時，野生型蛋白能夠進(jìn)行正確的自我剪切成熟，而突變體只能夠

9、進(jìn)行剪切形成中間形式的蛋白，不能形成成熟的蛋白。
　　 4 Q4041突變基因的克隆及功能研究
　　 我們從N22輻射誘變突變體庫中篩選獲得了一谷蛋白前體部分增加的突變體Q4041，該突變體還表現(xiàn)為成熟酸性和堿性亞基的部分減少，脂肪含量、游離氨基酸含量和賴氨酸含量大大增加，直鏈淀粉含量下降，種子變小，胚乳不透明等。對成熟胚乳自然斷面的掃描電鏡觀察顯示，Q4041中淀粉粒形狀不規(guī)則，且排列疏松。突變體和野生型正反交試驗表明

10、突變性狀受單個隱性核基因控制。利用Q4041/熱研2號F2群體將目的基因定位于第12染色體末端BAC克隆OJ1584_D02中27kb的區(qū)域，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測到該區(qū)域存在一個Rab5a基因，我們將它命名為osRab5a?；蚪M和cDNA序列分析表明osrab5a在第3個外元缺失了13bp，造成移碼突變，蛋白翻譯提前終止。我們構(gòu)建了一系列的轉(zhuǎn)基因載體對該基因進(jìn)行功能互補研究、亞細(xì)胞定位、體外表達(dá)研究等。同時我們對Q4041和N22發(fā)