人源抗CTGF單鏈抗體二聚體的制備及其對人氣管平滑肌細胞增殖作用的影響.pdf

1、背景:哮喘是氣道慢性炎癥性疾病，其病理生理特征主要包括氣道高反應(yīng)和氣道重塑。氣道重塑是氣道在炎癥因子的刺激下，發(fā)生的氣道壁結(jié)構(gòu)的改變，主要包括細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的沉積;氣管平滑肌細胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)增殖和肥大;氣道上皮細胞(airway epithelial cell，AEC)的破壞和杯狀細胞的增生等。結(jié)締組織生長因子（connective

2、tissue growth factor, CTGF）是近年發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)下游作用因子，具有促進細胞增殖、ECM的沉積、血管生成、介導細胞粘附、刺激細胞遷移等作用;抑制其活性可有效減少ECM的沉積、細胞增殖及氣道重塑作用，這可能會成為治療支氣管哮喘的有效方法。
　　目的:制備抗結(jié)締組織生長因子單鏈抗體(single-chain Fv antibody，sc

3、Fv)二聚體，并鑒定其生物活性;觀察其對人氣管平滑肌(ASM)細胞增殖的影響以及初步探討可能的作用機制。
　　方法:構(gòu)建pET28a-scFv-matrilin表達質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到Ecoli.BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，IPTG誘導表達融合蛋白scFv-matrilin，經(jīng)過鎳柱親和層析得到抗CTGF單鏈抗體-matrilin融合蛋白二聚體，SDS-PAGE、Native-PAGE電泳檢測其純度，ELISA法檢驗其免疫學活性。C

4、TGF干預(yù)人氣管平滑肌細胞，以MTT法檢測氣管平滑肌細胞增殖情況。用scFv二聚體與人氣管平滑肌細胞共孵育后，通過RT-PCR檢測各組細胞中mTOR mRNA的表達水平，Western Blot檢測scFv二聚體對HASMCs的p-Akt、p-mTOR表達的影響。
　　結(jié)果:SDS-PAGE、Native-PAGE電泳顯示經(jīng)過親和層析得到的抗CTGF單鏈抗體二聚體純度在90％以上，ELISA實驗表明抗體能夠與CTGF特異性結(jié)合;C

5、TGF可促進入氣管平滑肌細胞增殖;RT-PCR檢測顯示，CTGF對人氣管平滑肌細胞的mTOR上調(diào)表達作用能夠被抗CTGF單鏈抗體二聚體所抑制;Western Blot結(jié)果顯示，抗CTGF單鏈抗體二聚體可抑制人氣管平滑肌細胞Akt及mTOR的磷酸化。
　　結(jié)論:我們制備了純度較高的且能夠與CTGF特異性結(jié)合的抗CTGF單鏈抗體二聚體，這種單鏈抗體二聚體能夠抑制人氣管平滑肌細胞增殖;推測這種效應(yīng)的機制可能是通過PI3K/Akt/mTO