Flotillin-2在鼻咽癌中的表達及作用機制的初步探索.pdf

1、鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是東南亞和我國南方省份高發(fā)的惡性腫瘤。其病因可能涉及EB病毒感染、化學致癌物作用及基因突變和表觀遺傳學變異等多個因素。
　　 鼻咽癌細胞系5-8F和6-10B是從SUNE-1細胞系中分離出的兩個亞系，雖然遺傳背景相同，但是它們的轉(zhuǎn)移能力差別很大。本課題組利用這一特點，通過抑制性消減雜交技術，構(gòu)建了兩株細胞間差異表達基因的消減cDNA文庫，從中篩選出了一批在高轉(zhuǎn)移鼻

2、咽癌細胞系5-8F中表達上調(diào)的基因，進一步挑選出Flotillin-2(FLOT2)基因進行后續(xù)研究。
　　 FLOT2蛋白最早是在金魚視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞軸突再生過程中發(fā)現(xiàn)的，它具有廣泛的生物學功能，參與軸突再生、神經(jīng)元分化、胞吞作用、T淋巴細胞活化、脂筏構(gòu)成、膜蛋白招募及促進黑色素瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移等過程。
　　 前期工作中，利用RNA干擾方法降低5-8F細胞系中FLOT2基因的表達水平，我們發(fā)現(xiàn)5-8F細胞系增殖、侵襲、運動

3、、轉(zhuǎn)移能力均下降，而G1期細胞比例增加。這些結(jié)果提示FLOT2可能與鼻咽癌的轉(zhuǎn)移相關。
　　 本研究在前期工作的基礎之上，檢測了各種鼻咽癌細胞系中FLOT2基因mRNA的表達水平。同時，采用免疫組織化學方法檢測了38例慢性鼻咽炎患者、45例未轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者和87例轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者組織切片中FLOT2蛋白的表達水平。接著抽提了穩(wěn)定干擾FLOT2基因的5-8F細胞總RNA，進行基因表達譜芯片實驗和生物信息學分析，并對部分芯片結(jié)果進行了

4、初步的驗證。最后對FLOT2基因啟動子區(qū)域進行生物信息學預測，利用Wnt信號通路激活劑BIO刺激5-8F和6-10B細胞，于不同時間檢測FLOT2表達水平和啟動子活性。
　　 RT-PCR結(jié)果顯示，在鼻咽癌細胞系中，5-8F、HNE-1、HNE-2、HNE-3、CNE-1、CNE-2、HONE-1、HK-1、C666-1九個細胞系中表達較強的FLOT2，而6-10B細胞中FLOT2 mRNA的表達水平最低，但仍高于NP69正常鼻

5、咽上皮細胞系。免疫組化結(jié)果顯示，從慢性鼻咽炎組織到未轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織，再到轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織中，F(xiàn)LOT2的表達水平依次升高(P＜0.001)?；虮磉_譜芯片和生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LOT2基因干擾后，5-8F細胞中p53信號通路活化，TGF-β信號通路被抑制，多個細胞粘附相關分子、細胞周期相關分子表達水平發(fā)生了明顯的變化。RT-PCR和/或定量PCR結(jié)果證實，F(xiàn)LOT2表達下調(diào)后，與鼻咽癌轉(zhuǎn)移負相關的E-cadherin以及細胞周期負相關因

6、子p21表達均明顯上調(diào)。
　　 生物信息學軟件預測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LOT2基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游2000bp范圍內(nèi)存在多個啟動子和Wnt信號通路轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。我們構(gòu)建了包含F(xiàn)LOT2啟動子和Wnt信號通路轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的熒光素酶報告基因載體。BIO刺激后48h，6-10B與5-8F細胞內(nèi)FLOT2基因啟動子區(qū)域活性明顯上調(diào)，F(xiàn)LOT2表達水平也明顯上調(diào)。
　　 綜合上述結(jié)果，我們得出以下結(jié)論:FLOT2在鼻咽癌細胞系和組織中