抗人CD86單鏈抗體的研制及生物學(xué)功能研究.pdf

1、CD86（又稱(chēng)B7-2）是表達(dá)在抗原提呈細(xì)胞（antigen-presenting cell，APC）表面的重要共刺激分子，其受體是表達(dá)在T細(xì)胞表面的CD28分子。CD86與CD28結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)，對(duì)T細(xì)胞的活化、增殖與功能發(fā)揮起著重要作用。CD86的編碼基因?yàn)?120bp，由306個(gè)氨基酸組成，屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白。單鏈抗體（single chain variable fragment，scFv）是一種新型重組抗體，是將抗體重鏈可變區(qū)（

2、VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）用一條彈性短肽連接而成的小分子抗體片段，此類(lèi)抗體的優(yōu)點(diǎn)是分子量小、免疫原性弱、滲透性強(qiáng)、并具有藥物導(dǎo)向及中和毒素等功能。本研究在成功制備了鼠抗人CD86單克隆抗體及其相應(yīng)人-鼠嵌合抗體的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了抗人CD86-scFv的真核表達(dá)載體并在CHO細(xì)胞中得到穩(wěn)定表達(dá)，進(jìn)而對(duì)該抗體的生物學(xué)功能進(jìn)行了初步研究。
　　第一部分抗人CD86單鏈抗體（CD86-scFv）的構(gòu)建及表達(dá)
　　目的：構(gòu)建抗人CD86

3、-scFv基因并在CHO細(xì)胞中表達(dá)，篩選穩(wěn)定表達(dá)該抗體的細(xì)胞株。
　　方法：采用RT-PCR從分泌鼠抗人CD86單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株（克隆號(hào)：1D1）中克隆VH及VL基因。重疊延伸拼接PCR（gene splicing by overlap extension PCR，SOE-PCR）方法構(gòu)建具有前導(dǎo)肽的L-VH-Linker-VL單鏈抗體基因，并克隆至真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（C

4、HO），G418加壓篩選，采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定出穩(wěn)定表達(dá)抗人CD86-scFv的細(xì)胞株。
　　結(jié)果：構(gòu)建的抗人CD86-scFv基因全長(zhǎng)為780bp，測(cè)序后經(jīng)BLAST比對(duì)，證明該序列為鼠源親本抗體的可變區(qū)基因，并含有信號(hào)肽、連接肽以及His標(biāo)簽。轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，G418加壓篩選后獲得了穩(wěn)定表達(dá)抗人CD86-scFv的細(xì)胞株，命名為SA-IV。培養(yǎng)上清與L929-CD86細(xì)胞的陽(yáng)性結(jié)合率為64.8%。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了穩(wěn)定

5、表達(dá)抗人CD86-scFv的細(xì)胞株SA-IV，為進(jìn)一步研究該抗體的生物學(xué)活性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　第二部分抗人CD86-scFv的生物學(xué)功能研究
　　目的：制備抗人CD86-scFv，分析其與不同人源細(xì)胞株膜型CD86分子的結(jié)合特性及介導(dǎo)的生物學(xué)功能。
　　方法：大批量培養(yǎng)細(xì)胞株SA-IV，收集上清，Profinity TM IMAC鎳預(yù)裝柱分離純化CD86-scFv。采用流式細(xì)胞術(shù)分析CD86-scFv對(duì)基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞

6、株L929-CD86以及天然表達(dá)CD86分子的人B系淋巴瘤細(xì)胞Raji和Daudi膜型CD86分子的識(shí)別。競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)分析該抗體與鼠源親本抗體1D1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合相應(yīng)抗原的能力。在Raji細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入不同濃度的CD86-scFv，MTT法分析CD86-scFv對(duì)Raji細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞術(shù)分析該抗體誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡的作用。CD86-scFv與Raji細(xì)胞共孵育后接種BABL/c裸鼠，觀察抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞成瘤性的影響。
　

7、　結(jié)果：經(jīng)大量培養(yǎng)SA-IV并收集培養(yǎng)上清，鎳預(yù)裝柱分離純化CD86-scFv的得率為4.2mg/L。CD86-scFv能特異性識(shí)別L929-CD86、Raji以及Daudi細(xì)胞表面的CD86分子，陽(yáng)性結(jié)合率分別為67.0%、72.3%及80.5%。該抗體對(duì)鼠源親本抗體1D1具有競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合能力。在Raji細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入CD86-scFv，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為28.3%，凋亡率為11.2%。Raji細(xì)胞與CD86-scFv共孵育后接種BAL