4種牛病毒性傳染病的定性及定量PCR檢測方法.pdf

1、本研究建立了牛地方流行性白血病病毒(BLV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(BHV1)、牛病毒性腹瀉粘膜病毒(BVDV)和赤羽病病毒(AKV)各種病毒單一的PCR檢測方法，分別擴增BLV gp51基因341bp的片段、BHV1 gB基因478bp的片段、BHV1 gE基因271bp片段、AKV S RNA365bp片段和BVDV的UTR基因289bp的片段。 考慮到BLV通常都以前病毒(DNA病毒)的形式整合于宿主細胞的情況，本研究建立

2、了BLV前病毒和BHV1同步PCR檢測方法，同步擴增BLV gp51基因341bp的片段和BHV1 gB基因478bp的片段。 本研究建立了BVDV和AKV兩種RNA病毒同步PCR檢測方法，分別選取AKV和BVDV特異性引物AKVf1/AKVrl和BVDVf1/BVDVr1，建立兩種RNA病毒同步RT-PCR反應體系，可以同步擴增AKV基因的365bp的片段和BVDV的UTR基因289bp的片段。根據(jù)BLV高度保守的gp51基因

3、序列分別設計一對引物及其相應的Taqman探針，建立并優(yōu)化反應體系，該方法與AKV、BVDV、IBR等均無交叉反應，在對已知拷貝數(shù)的含BLV質粒的擴增中，其檢測靈敏度達到260個拷貝/μL，比用常規(guī)PCR對相同模板進行擴增的靈敏度高1000倍。本方法簡便、快速，從核酸提取到獲得結果只需3h。構建了含牛地方流行性白血病病毒(BLV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(BHV1)、牛病毒性腹瀉粘膜病毒(BVDV)和赤羽病病毒(AKV)四種病毒相關基因的

4、載體質粒作為病毒DNA或RNA陽性對照，研制了牛地方流行性白血病病毒(BLV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒( BHV1)、牛病毒性腹瀉粘膜病毒(BVDV)和赤羽病病毒(AKV)各種單一病毒的PCR檢測試劑盒，以及BLV前病毒和BHV1二重PCR檢測試劑盒和AKV和BVDV單管二重RT-PCR檢測試劑盒。對試劑盒的重復性結果表明，各個試劑盒重復性較好，但反復凍融會有所影響，因此推薦開啟后盡快一次用完。保存期試驗結果表明，試劑盒在-20℃能保存六