尼羅羅非魚性別決定機制和性別相關的分子標記.pdf

1、尼羅羅非魚已成為世界性的主要養(yǎng)殖對象之一，研究表明其遺傳性別決定類型為XX/XY型。對不同遺傳型尼羅羅非魚的有絲分裂中期相染色體進行熒光原位雜交表明，在尼羅羅非魚中，X與Y染色體之間存在差異。但是到現(xiàn)在為止，沒有發(fā)現(xiàn)性別特異分子標記。遺傳性別的快速鑒定問題是尼羅羅非魚性別控制研究中的一個難點。本文從DNA水平對雌雄尼羅羅非魚進行比較，研究其性別控制機理，篩選能區(qū)分雌雄的分子標記。主要研究結果如下： 1.本文參照不同物種DM結構域

2、設計了一對兼并引物，以尼羅羅非魚精巢RNA為模板，通過RT-PCR方法，擴增出一條帶，長約140bp。對擴增產(chǎn)物進行克隆，陽性克隆采用SSCP分析篩選不同基因片段，進一步對篩選的不同基因進行了DNA測序。結果獲得2個不同的 Dmrt 基因，與GenBank 聯(lián)機，采用 BLAST 方法與人類相應 DMRT 基因進行序列比對，發(fā)現(xiàn)與人類相應 DMRT 基因的氨基酸序列一致性分別為：89.1％、100％，顯示出 Dmrt 基因在系統(tǒng)進化上具

3、有高度的保守性。根據(jù)尼羅羅非魚的拉丁文名，按習慣將其命名為onDmrt1，onDmrt2。為了探討Dmrt1和Dmrt2兩個基因的功能，根據(jù)獲得的序列，分別設計一對特異引物，采用RT-PCR技術，對尼羅羅非魚不同組織Dmrt1和Dmrt2基因的表達進行了研究。結果發(fā)現(xiàn)Dmrt2基因在精巢，卵巢，腦，眼，鰓，心臟中都有表達，暗示Dmrt2基因的功能可能主要是參與器官發(fā)育，而不是性別決定過程。而Dmrt1 只在精巢中特異表達，在其它組織中無

4、表達，顯示Dmrt1基因主要在性別決定及性狀維持中有重要功能。根據(jù)擴增出的Dmrt1 DM-domain的序列，設計上游引物P5，P6，用3‘RACE法從尼羅羅非魚精巢中分離和測定了Dmrt1 cDNA的序列，3'-RACE擴增得到1108bp的片段，共編碼262個氨基酸，奧利亞羅非魚、虹鱒、新月魚、青鯔等動物的Dmrt 1的氨基酸序列進行比較，同源性分別為：99％，62％，73％，41％。以Dmrt 1基因組序列為基礎，采用Gamie

5、r-Robson方法、Chou-Fasman方法和Karplus-Schulz方法預測蛋白質的二級結構；按Kyte-Doolittle方案、Emini方案和Jameson-Wolf方案預測DMRT1蛋白的B細胞表位，為精確地研究DMRT1蛋白的結構和功能，從而揭示他們的性別調控機能提供參考。 2.參照人SRY基因HMG-box保守區(qū)序列，設計一對兼并引物，采用PCR技術擴增了尼羅羅非魚Sox基因，在雌雄尼羅羅非魚個體中均擴增出五

6、條帶，大小分別約為200 bp，400 bp，600 bp，800 bp，1200bp，回收200bp左右擴增產(chǎn)物進行克隆，陽性克隆采用SSCP分析，篩選不同基因片段。進一步對篩選的不同基因進行DNA測序，結果獲得了五個不同的228bp Sox基因，與GenBank聯(lián)機，采用BLAST 方法與人類相應 SOX 基因進行序列比對，發(fā)現(xiàn)其與人類相應SOX蛋白的氨基酸序列一致性分別為97.2％、97.2％、94.4％、96％、88.2％，顯示

7、出該基因在分子進化上具有高度的保守性。根據(jù)尼羅羅非魚的拉丁文名，按習慣將其命名為onSox1a、onSox1b、onSox3、onSox4 and onSox12。采用RT-PCR 技術，研究了尼羅羅非魚精巢、卵巢、腦、眼、鰓和心臟等組織中Sox3基因的表達。結果顯示，Sox3基因在精巢、卵巢、腦和眼中有不同程度表達，而在鰓和心臟中無表達，證實Sox3基因在其中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，性腺發(fā)生和功能維持上有著重要功能。本研究為探索尼羅羅非魚的

8、性別決定機制和Sox基因表達模式提供了資料。 3.采用RAPD技術對尼羅羅非魚雌、雄各11尾個體共22個樣本進行性別和遺傳多樣性檢測。從80個寡聚核苷酸隨機引物中篩選出17個擴增重復性好、條帶清晰、特異性強的引物，對每個個體基因組 DNA 進行了擴增。得到RAPD產(chǎn)物的分子量在200-2000bp之間，產(chǎn)物總計127個位點，其中，多態(tài)位點45個(占35.43％)。計算個體間遺傳相似系數(shù)平均為0.8648，個體間遺傳距離平均為0.

9、1352。用Shannon多樣性指數(shù)量化的遺傳多態(tài)度(H<,0>)，雄性群體(0.1910)高于雌性群體(0.1797)，平均遺傳多態(tài)度(Hpop)為0.1854。尼羅羅非魚遺傳多態(tài)度所占的比例在群體內為13.63％，而雌、雄群體間為86.37％。在尼羅羅非魚雌、雄個體RAPD產(chǎn)物中，電泳圖譜上不能讀出明顯的雄性特征帶。 4.利用 AFLP 技術，應用49個引物組合，檢測了尼羅羅非魚雌雄基因組 DNA的多態(tài)性，篩選與尼羅羅非魚性

10、別相關的分子標記。實驗中共擴增出 2694 條帶，篩選出候選差異DNA片段748條。挑選出20對引物進行雌雄兩代個體進一步的分析。其中引物E4/M5組合產(chǎn)生1個大小約為150bp的片段，在所有兩代雄性尼羅羅非魚均出現(xiàn)這一片段，在F1代的15尾雌尼羅羅非魚中有僅有 1 尾出現(xiàn)該片段，對F2代15尾雌尼羅羅非魚也只有2出現(xiàn)，由此推斷此條帶可能與性別相連鎖。對該特異擴增帶經(jīng)回收和測序，為了將AFLP標記轉化為重復性和特異性更好的SCAR標記，