低氧環(huán)境下干細胞因子表達及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制研究.pdf

1、一.干細胞因子(stem cell factor，SCF)是一種多功能細胞因子，參與造血、哮喘、腫瘤增殖和血管新生等多種生理和病理活動。雖然低氧環(huán)境可以誘導SCF基因表達，但具體的調(diào)節(jié)機制仍未闡明。低氧誘導因子-1(Hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是參與低氧信號調(diào)節(jié)的重要轉(zhuǎn)錄因子。本研究旨在探討HIF-1是否參與低氧誘導的SCF基因表達，以期闡明SCF在腫瘤細胞中的表達調(diào)控機制。 方法：MCF-

2、7細胞置于低氧(1.5％O<,2>)和常氧(20％O<,2>)環(huán)境進行培養(yǎng)。利用RNA干擾技術沉默HIF-1α基因在MCF-7細胞中的表達。SCF mRNA和蛋白分別用實時定量PCR、蛋白印跡(WesteFrlblot)和酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)進行檢測。染色體免疫共沉淀實驗(ChIP)用來檢測HIF-1與SCF基因啟動子在活細胞內(nèi)的結合情況。HIF-1α真核表達質(zhì)粒和SCF基因啟動子熒光素酶報告基因共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，SCF

3、基因轉(zhuǎn)錄情況應用熒光素酶分析進行檢測。應用表皮生長因子(EGF)刺激HIF-1α和SCF在常氧條件下的表達。 結果：低氧在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)SCF基因表達。沉默HIF-1α基因顯著下調(diào)SCF mRNA和蛋白表達。分析SCF基因啟動子5’非編碼區(qū)，發(fā)現(xiàn)存在經(jīng)典的低氧反應元件(HRE;5’-GCGTG-3’)，存在于距離轉(zhuǎn)錄起始點-68至-64個核苷酸區(qū)域。染色體免疫共沉淀分析發(fā)現(xiàn)HIF-lα在常氧條件下直接結合SCF的HRE區(qū)域，并且這

4、種結合效應隨著低氧信號刺激而增強。過表達HIF-1α增強SCF啟動子在MCF-7和HEK293細胞中的表達，突變HRE后這種增強效應消火。我們也發(fā)現(xiàn)EGF可以在常氧條件下上調(diào)SCF基因表達，并且這種上調(diào)作用依賴HIF-1α。 結論：SCF是一個新的受HIF-1α直接調(diào)控的靶基因。低氧和EGF信號共同存在于腫瘤微環(huán)境中，二者協(xié)同作用，通過HIF-1α上調(diào)SCF和其他血管新生因子，促進腫瘤組織血管新生。 二.慢性特發(fā)性血小板

5、減少性紫癜(chronic ITP)是抗血小板抗體介導的一種器官特異性自身免疫性疾病。瘦素是由脂肪細胞分泌的多功能細胞因子，最近研究表明，瘦素參與多種自身免疫性疾病的發(fā)生過程。本研究旨在探討瘦素在該疾病發(fā)病過程中的免疫學行為。 方法：ELISA法檢測慢性ITP患者血漿中的瘦素及其可溶性受體的表達;實時熒光定量PCR檢測慢性ITP患者外周血單個核細胞長型瘦素受體(Ob-Rb)mRNA的表達；重組瘦素刺激體外培養(yǎng)慢性ITP患者來源的

6、脾及外周血單個核細胞，競爭性ELISA法評價不同劑量瘦素對IgG抗血小板抗體產(chǎn)生的作用；利用磁珠分選法從脾細胞中分選出CD4<'+>T細胞，比較去除CD4<'+>T細胞前后，瘦素刺激的IgG抗血小板抗體產(chǎn)生是否存在差異。有限稀釋法測定瘦素刺激前后血小板反應性T細胞群數(shù)量的差異。 結果：慢性ITP 患者中血漿瘦素水平(中位數(shù)：29.4ng/ml)顯著高于正常對照組(中位數(shù)：2.2ng/ml，p<0.001)，血漿可溶性瘦素受體水平

7、(中位數(shù)：15.5ng/m1)顯著低于正常對照組(中位數(shù)：21.9ng/ml，p=0.03)。實時定量PCR測定慢性ITP患者來源的外周血單個核細胞瘦素長型受體mRNA較正常對照組增高約2.1倍，(P=0.03)。體外施加重組瘦素或者慢性ITP患者來源的高瘦素血清，可以誘導慢性，ITP患者脾及外周血單個核細胞產(chǎn)生1gG抗血小板抗體增加。從脾細胞中去除CD4<'+>T細胞后，瘦素不能誘導IgG抗血小板抗體的產(chǎn)生。有限稀釋法測定，經(jīng)瘦素刺激