應用RNAi技術沉默STAT1基因?qū)ο∈驣NF-γ、IL-5、ICAM-1表達的影響.pdf

1、目的:STAT1參與調(diào)節(jié)多種細胞因子和生長因子的細胞反應,是連接各種膜受體和效應器之間的信號轉(zhuǎn)導途徑。它主要是調(diào)節(jié)細胞的增值、分化、凋亡。在哮喘的發(fā)病中JAK/STAT信號通路也起著重要的作用。有研究表明,機體STAT1的表達水平對免疫的調(diào)節(jié)和炎癥反應起著決定性的作用。因此目前在呼吸系統(tǒng)的疾病中對JAK/STAT信號通路的研究同樣集中在哮喘上。正因為JAK/STAT信號通路存在細胞因子特異性,因此阻斷某種JAK/STAT通路就可以阻斷其

2、相對應的細胞因子的作用。RNA干擾是一種強有效的抑制基因功能的工具。它能夠促進靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的降解,進而阻止mRNA翻譯成相應的蛋白質(zhì)。本實驗應用RNA干擾技術(RNA interference,RNAi)沉默轉(zhuǎn)導子與轉(zhuǎn)錄活化子1(signal transducer and activator of transcription1 STAT1)基因,探討其對支氣管哮喘小鼠STAT1蛋白與INF-γ、IL-5、ICAM-1的表達的

3、影響。使基因治療成為可能導致治療或者甚至預防性治療支氣管哮喘等氣道慢性炎癥性疾病的新方法。
　　方法:32只4周齡BALB/C雌鼠隨機分為4組;分別為正常組、PBS組、空質(zhì)粒組(隨機片段RNAi)和siRNA組(pG-2)。PBS組、空質(zhì)粒組和siRNA組分別用新鮮配制的OVA/Al(OH)3混懸液(100ugOVA+1mgAl(OH)3干粉加入1mlPBS液配制而成),分別于第1天和第14天腹腔注射OVA/Al(OH)3混懸液,

4、使BABL/C小鼠致敏;而正常組用1mL的生理鹽水腹腔注射。在第26-29天siRNA組濃縮的siRNA40ul(100ug)滴鼻;PBS組用40ulPBS液滴鼻;空質(zhì)粒組用隨機片段RNAi40ul滴鼻。正常組用生理鹽水滴鼻。在第28-30天正常組用生理鹽水滴鼻,PBS組、空質(zhì)粒組及siRNA組用OVA溶液50ul(50ug)滴鼻激發(fā)哮喘,在末次滴鼻后12小時引頸處死小鼠。通過單肺灌洗留取肺泡灌洗液(BALF)進行細胞計數(shù)和分類計數(shù)。取

5、BALF上清液,應用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA),檢測其中的γ干擾素(IFN-γ)、白細胞介素5(IL-5)、細胞間粘附分子1(ICAM-1)的表達水平。肺組織切片做免疫組織化學染色及HE染色。采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析和隨機區(qū)組設計的方差分析,多個樣本均數(shù)之間的多重比較用LSD法,以P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。同時分析BALF中炎癥細胞數(shù)與IFN-γ,IL-5,ICAM-1間相關性。
　　結果:(

6、1)正常組小鼠肺組織切片HE染色可見;支氣管內(nèi)壁光滑,肺泡間隔菲薄,肺泡腔內(nèi)未見炎性滲出物?？召|(zhì)粒組及siRNA組哮喘小鼠肺組織病理切片HE染色可觀察到:支氣管粘膜水腫,支氣管及血管周圍有大量的炎癥細胞的浸潤,以Eos為主;肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)也可見Eos的浸潤。細、小支氣管內(nèi)可見黏液栓。氣道上皮多處斷裂,基底膜明顯增厚且形態(tài)不規(guī)則。而siRNA組炎癥細胞的浸潤及黏液的分泌較空質(zhì)粒組與PBS組比較明顯減輕。(2)STAT1蛋白主要表達與小鼠

7、的氣道上皮細胞。(3)siRNA組STAT1蛋白表達水平明顯低于PBS組及空質(zhì)粒組,但高于正常組。IL-5、ICAM-1的表達水平亦呈類似改變,而IFN-γ則呈相反的改變。(4)正常組的肺泡灌洗液中白細胞數(shù),嗜酸性粒細胞(EOS)以及淋巴細胞(LC)數(shù)量較PBS組、空質(zhì)粒組及siRNA組減少。而siRNA組肺泡灌洗液中的細胞總數(shù)就各種細胞數(shù)均較PBS組與空質(zhì)粒組減少,它們之間的差異都有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　結論:1.哮