Angptl2對主動脈血管平滑肌細胞鈣化的影響.pdf

1、目的:
　　炎癥因子可促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展及動脈粥樣硬化鈣化的生成，而平滑肌細胞在動脈粥樣硬化鈣化中起到很關鍵的作用，血管生成素樣蛋白2(ANGPTL2)作為一種炎癥因子具有很強的致動脈粥樣硬化作用，其是否對血管鈣化產(chǎn)生影響尚未有研究報道，本研究旨在觀察血管生成素樣蛋白2對主動脈血管平滑肌細胞(VSMC)鈣化的影響。
　　方法:
　　本實驗采用A7r5細胞株作為鈣化模型制作細胞，用含10mmol/Lβ甘油磷酸鹽(

2、β-GP)培養(yǎng)液培育9d建立體外細胞鈣化模型，馮庫薩染色法鑒定細胞鈣化;首先用重組ANGPTL2濃度梯度干預后，Western blot方法檢測Runx2蛋白表達水平，馮庫薩染色法鑒定各組細胞的鈣化程度，鈣離子檢測試劑盒檢測各組細胞鈣離子含量并測量蛋白標化，堿性磷酸酶檢測試劑盒檢測各組細胞間堿性磷酸酶活性并測量蛋白標化。重組ANGPTL2時間梯干預后，Western blot方法檢測Runx2蛋白表達水平，鈣離子檢測試劑盒檢測各組細胞鈣

3、離子含量并測量蛋白標化，堿性磷酸酶檢測試劑盒檢測各組細胞間堿性磷酸酶活性并測量蛋白標化。最后重組ANGPTL2干預及抗ANGPTL2中和抗體阻斷其生物學活性，每次首先加入重組ANGPTL2孵育30min后，用PBS清洗兩邊后加入抗ANGPTL2中和抗體，每3d換液一次，孵育9d后，共聚焦顯微鏡觀察各組細胞間鈣化程度的形念學差異，鈣離子檢測試劑盒檢測各組細胞鈣離子含量并測量蛋白標化，堿性磷酸酶檢測試劑盒檢測各組細胞間堿性磷酸酶活性并測量蛋

4、白標化。CCK8檢測ANGPTL2對血管平滑肌細胞增殖的影響。
　　結果:
　　(1)β甘油磷酸鹽(β-GP)誘導9d后成功建立血管平滑肌細胞鈣化模型。
　　(2) ANPTL2對細胞鈣化的影響呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性，在10ng/ml濃度細胞鈣化及鈣離子沉積量、堿性磷酸酶活性、Runx2蛋白的表達量達到最強生物學效應，ANGPTL2干預血管平滑肌細胞后，Runx2蛋白表達顯著增高，并且呈現(xiàn)出時間依賴性，蛋白表達在第9d

5、增加最為明顯，同樣的細胞鈣堿性磷酸酶活性也在第9d達到峰。
　　(3)馮庫薩染色結果顯示經(jīng)ANGPTL2干預9d后血管平滑肌細胞鈣化程度較同型對照組顯著增加，而阻斷ANGPTL2生物學活性后細胞鈣化程度較干預組顯著降低，ANGPTL2可促進血管平滑肌細胞鈣離子的沉積量增加，堿性磷酸酶的活性及鈣化生物學標記物Runx2的蛋白表達量均較同型對照組顯著增加，經(jīng)抗ANGPTL2中和抗體阻斷后細胞鈣離子沉積量、堿性磷酸酶活性、Runx2蛋白