小鼠T調(diào)節(jié)細(xì)胞“默認(rèn)性”生成的機(jī)制及其運(yùn)用.pdf

1、目的：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）在維持自身免疫耐受和體內(nèi)免疫平衡中起到非常重要的作用。先前已經(jīng)報(bào)道了新生CD4陽性T細(xì)胞在T細(xì)胞受體（TCR）信號(hào)的刺激下具有內(nèi)在“默認(rèn)性”機(jī)制成為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。然而，目前“默認(rèn)性”機(jī)制的原理尚不清楚，而且neoTreg細(xì)胞對(duì)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的作用也未清楚，因此將對(duì)內(nèi)在“默認(rèn)性”機(jī)制進(jìn)行探究并延伸運(yùn)用。
　　方法：由于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）參與Foxp3的調(diào)節(jié)，在Foxp3gfp小鼠中對(duì)比檢測(cè)了

2、新生鼠及成年鼠在誘導(dǎo)Treg細(xì)胞過程中DNMT1和DNMT3b在mRNA和蛋白水平的表達(dá)量及蛋白水平的表達(dá)活性差異。再通過甲基化檢測(cè)技術(shù)對(duì)neoTreg細(xì)胞及成年小鼠誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的Foxp3基因上的非編碼保守序列-2的甲基化狀態(tài)對(duì)比。進(jìn)一步通過以RAG2-/-（B6）小鼠作為受體接受同種異體(BALB/c)心臟移植并過繼性輸注同基因的CD4陽性效應(yīng)T細(xì)胞建立急性排斥反應(yīng)模型后，過繼性輸注neoTreg細(xì)胞對(duì)其抑制急性排斥反應(yīng)及體內(nèi)穩(wěn)

3、定性進(jìn)行評(píng)估。最后通過甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑（5-Aza）在成年小鼠Treg誘導(dǎo)過程中抑制甲基化轉(zhuǎn)移酶的活性生成5-Aza-Treg細(xì)胞，并通過上述neoTreg的各項(xiàng)檢測(cè)手段檢測(cè)5-Aza-Treg細(xì)胞的Treg細(xì)胞相關(guān)生物標(biāo)志及功能。
　　結(jié)果：通過體外TCR刺激，DNMT1及DNMT3b基因和蛋白的表達(dá)量在成熟的CD4陽性T細(xì)胞增加了3-5倍，但在新生CD4陽性T細(xì)胞中無顯著增加。進(jìn)一步過繼性輸注neoTreg細(xì)胞能顯著延長移植

4、心臟存活時(shí)間（平均存活時(shí)間[MST]：47天，p<0.001），并能保持接近于天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（nTreg細(xì)胞）相似的Foxp3的表達(dá)量。與成熟CD4陽性細(xì)胞誘導(dǎo)生成的Treg細(xì)胞對(duì)比，neoTreg細(xì)胞在Foxp3基因的保守非編碼DNA序列（CNS）2位點(diǎn)呈低甲基化狀態(tài)。DNMT的拮抗劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-氮雜）能在成熟的CD4陽性T細(xì)胞中誘導(dǎo)更多的Foxp3表達(dá)量。過繼性輸注5-氮雜誘導(dǎo)生成的Treg細(xì)胞聯(lián)合連續(xù)5-氮雜治