促紅細胞生成素通過抑制GSK3β介導的Bax線粒體轉位減少6-羥基多巴胺誘導的PC12細胞凋亡.pdf

1、本文分為以下兩個部分進行探討：
　　第一部分 6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導PC12細胞凋亡及其可能機制
　　目的：采用6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)誘導PC12細胞損傷建立帕金森病的體外模型，探討GSK3β在6-OHDA誘導的凋亡途徑中的具體作用及6-OHDA對PC12凋亡的可能作用機制。
　　方法：采用6-羥基多巴胺誘導PC12細胞損傷建立帕金森病的體外模型，通過MTT檢測以

2、及臺盼藍染料排除試驗檢測不同濃度的6-OHDA處理后的PC12細胞活性和生存率。利用免疫印跡法測定:1、總GSK3β和p-GSK3β水平;2、Bax和β-肌動蛋白水平，β-肌動蛋白用作細胞質內蛋白的內參對照;3、Bax和prohibition蛋白水平，prohibition蛋白用作線粒體內蛋白的內參對照。
　　結果：1、6-OHDA刺激24后呈劑量依賴性(10、20、50、100、200μm)地抑制PC12細胞的細胞活性及細胞存活

3、率。6-OHDA在100μM時顯著抑制PC12的活性和存活率。
　　2、Western blot檢測結果顯示，6-OHDA處理呈時間依賴性地減少了GSK3β磷酸化。通過提取細胞線粒體和細胞質來檢查Bax在細胞線粒體中存在的情況，結果顯示6-OHDA處理后細胞質中Bax含量減少了，線粒體中Bax含量增加了，提示6-OHDA誘發(fā)了Bax的線粒體轉位。
　　結論：6-OHDA顯著降低了PC12細胞的活性，促進了PC12細胞凋亡，G

4、SK3β在6-OHDA誘導的凋亡中起到一定作用，6-OHDA處理呈時間依賴性地減少GSK3β磷酸化，誘發(fā)了Bax的線粒體轉位，Bax可從細胞溶質轉位至線粒體中，引起線粒體功能障礙，進而導致細胞凋亡。
　　第二部分 促紅細胞生成素(EPO)對6-羥基多巴胺誘導PC12細胞凋亡的保護作用及其機制
　　目的：通過研究促紅細胞生成素對6-OHDA處理的PC12細胞的糖原合成酶激酶3β的磷酸化、Bax的線粒體轉位、Bcl-2表達水平、

5、半胱天冬酶3活性，探討促紅細胞生成素(EPO)抑制6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導的凋亡的機制。
　　方法：PC12細胞用TDZD-8(25μM)或用不同濃度的EPO(0-10U/mL)預處理，隨后用100μM6-OHDA孵育。采用MTT檢測和臺盼藍排除試驗測定不同處理后的細胞活性;免疫印跡法觀察GSK3β磷酸化水平、總GSK3β水平、Bax在細胞內分布情況、抗增殖蛋白水平、Bcl-2以及β-肌動蛋白水平;Hoechst3325

6、8染色法來估算凋亡PC12細胞的比例，使用半胱天冬酶3比色測定試劑盒系統(tǒng)估算半胱天冬酶3活性。
　　結果：1、EPO呈濃度依賴性地（濃度從1至10U/mL不等）降低6-OHDA誘導的生長抑制，GSK3β抑制劑4-苯基-2-甲基-1，2，4-噻二唑—3，5-二酮(TDZD8)顯著逆轉6-OHDA誘導的生長抑制。
　　2、EPO和TDZD-8顯著逆轉6-OHDA對GSK3β磷酸化的抑制，也顯著抑制6-OHDA誘導的Bax線粒體轉

7、位。
　　3、6-OHDA不改變細胞質內的Bcl-2表達水平，而EPO和TDZD-8兩者也不影響B(tài)cl-2的細胞質內表達水平。但6-OHDA顯著降低了Bcl-2的線粒體內表達水平，而加入EPO和TDZD-8后可逆轉6-OHDA誘導的Bcl-2的線粒體內表達降低。
　　4、EPO和TDZD-8抑制6-OHDA誘導的細胞凋亡，6-OHDA顯著增加半胱天冬酶3活性，而EPO和TDZD則顯著抑制半胱天冬酶3活性升高。
　　結論