桑樹(shù)扦插生根的轉(zhuǎn)錄組分析及MaSAUR2和MaHO-1基因的表達(dá)分析.pdf

1、本試驗(yàn)應(yīng)用Sole xa測(cè)序技術(shù)對(duì)桑樹(shù)兩種扦插方式生根發(fā)育過(guò)程插穗基部皮層進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)分析，并對(duì)在扦插生根過(guò)程中顯著差異表達(dá)的基因MaSAUR2與MaHO-1進(jìn)行了基因克隆、序列特征分析以及表達(dá)特征分析。
　　主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論如下：
　　1、根據(jù)插穗發(fā)育情況，采用夏秋季綠枝與秋末冬初綠枝扦插生根過(guò)程基部皮層材料構(gòu)建了7個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)：其中夏秋季綠枝扦插生根過(guò)程3個(gè)，分別為W1（對(duì)照未處理）、W2（基部膨大期）

2、、W3（不定根長(zhǎng)出皮層期）；秋末冬初綠枝扦插生根過(guò)程4個(gè)，分別為Q1（對(duì)照未處理）、Q2（基部膨大期）、Q3（發(fā)育停滯期）、Q4（不定根長(zhǎng)出皮層期）。經(jīng)過(guò)預(yù)處理，7個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的高質(zhì)量read s條數(shù)為52,756,096-88,216,727條。對(duì)其進(jìn)行蛋白功能注釋?zhuān)Y(jié)果7個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)注釋上的序列數(shù)分別為23837-39504，注釋率為35.81％-57.20%。根據(jù)contigs與蛋白功能注釋的對(duì)應(yīng)關(guān)系，將桑樹(shù)兩種綠枝扦插生

3、根發(fā)育過(guò)程中對(duì)應(yīng)發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行交叉分析，其中將數(shù)據(jù)庫(kù)W1與Q1、W2與Q2、W2與Q3、W3與Q4進(jìn)行分析，獲得兩兩共同擁有的基因，并分別將其命名為A、B、C、D數(shù)據(jù)庫(kù)。結(jié)果得到數(shù)據(jù)庫(kù)A中有14191個(gè)UniProt注釋?zhuān)籅中有14142個(gè)UniProt注釋?zhuān)籆中有13760個(gè)UniProt注釋?zhuān)籇中有12355個(gè)UniP rot注釋。數(shù)據(jù)庫(kù)A與B差異基因篩選得到77個(gè)差異基因，B與C篩選得到1752個(gè)差異基因，C與D篩選得到

4、1991個(gè)差異基因，并對(duì)差異基因進(jìn)行GO與KEGG功能富集聚類(lèi)。根據(jù)功能富集結(jié)果，對(duì)各個(gè)發(fā)育階段的差異基因進(jìn)行詳細(xì)分析，得出差異基因富集最多的通路主要為能量代謝、糖代謝、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期、生物的降解與合成等。
　　2、本試驗(yàn)從桑樹(shù)莖部皮層中克隆得到一條SAUR（Small auxin-up RNA）基因的cDNA序列，將其命名為 MaSAUR2（GenBank登錄號(hào)：KC852881）。序列分析顯示該基因編碼182個(gè)氨基酸殘

5、基，所編碼蛋白的分子質(zhì)量約為20.7kDa，理論等電點(diǎn)pI約為9.39，有1個(gè)SAUR-specific domain（SSD）。熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)根是MaSAUR2基因轉(zhuǎn)錄最活躍的組織，在莖和葉中表達(dá)量也相對(duì)較高，在芽中表達(dá)量相對(duì)較少，在熟果中沒(méi)有表達(dá)。應(yīng)用IAA溶液處理桑樹(shù)插穗，結(jié)果顯示插穗莖部皮層中的MaSAUR2基因在5min內(nèi)表達(dá)量迅速增加。在桑樹(shù)插穗不定根形成過(guò)程中，該基因在基部膨大期呈一個(gè)較低的表達(dá)水平，而在不定根

6、長(zhǎng)出皮層期表達(dá)水平顯著升高，推測(cè)MaSAUR2在桑樹(shù)不定根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用
　　3、從桑樹(shù)莖部皮層中克隆得到一條HO（heme oxygenase）基因的cDNA序列，將其命名為MaHO-1（GenBank登錄號(hào)：KJ544669）。序列分析顯示該基因編碼291個(gè)氨基酸殘基，所編碼的成熟蛋白分子量約為26.2kD，理論等電點(diǎn)pI約為8.79，有1個(gè)Hame oxygenase-like結(jié)構(gòu)域。熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)

7、現(xiàn)MaHO-1轉(zhuǎn)錄最活躍的組織是葉，其次依次是芽、莖、熟果、根。應(yīng)用IAA溶液處理桑樹(shù)插穗，結(jié)果顯示插穗皮層的MaHO-1基因的轉(zhuǎn)錄水平逐步上升，到6h表達(dá)量最大，之后表達(dá)量變化趨于平緩。在桑樹(shù)插穗不定根形成過(guò)程中，該基因維持一個(gè)較高的表達(dá)水平：從未處理到基部膨大期，表達(dá)量上升了5倍，之后表達(dá)量上升減緩。酶活性變化與基因表達(dá)量變化基本一致。并且MaHO-1表達(dá)量的上升發(fā)生在不定根形成之前。推測(cè)MaHO-1的上調(diào)表達(dá)在不定根的形成過(guò)程中發(fā)