胰腺癌甲基化異化基因的檢測、芯片篩查和診斷研究.pdf

1、目的：研究胰腺癌SPARC、SARP2基因CpG島的甲基化分布特征及其與臨床生物學特點的關系,以及定量檢測方法的建立,并用甲基化基因芯片篩查胰腺癌新的高甲基化異化基因。 方法：首先收集23例胰腺及癌旁組織、6例慢性胰腺炎和7例正常胰腺組織作為研究對象,健康成人外周血液標本6例作為對照組。抽提上述標本DNA進行重亞硫酸鹽修飾,然后進行PCR擴增SPARC、SARP2基因第一外顯子區(qū)CpG島區(qū)域,測序明確該區(qū)域CpG位點甲基化情況,

2、并與相應的臨床生物學特征的關系進行分析。另收集原發(fā)性胰腺癌10例、慢性胰腺炎10例和健康志愿者6例外周靜脈血10ml,取血清提取所有研究對象的血清DNA,重亞硫酸鹽修飾后,行SARP2基因BSP擴增測序。其后制備SPARC和ACTB基因檢測標準品,同時設計其定量檢測引物和探針,建立SPARC基因定量檢測方法。最后用甲基化基因芯片篩查胰腺癌高甲基化異化基因。 結果：1.健康人白細胞、正常胰腺、慢性胰腺炎、胰腺癌及癌旁組織SPARC

3、基因第一外顯子區(qū)CpG位點甲基化率分別0％、12.4％、25.1％、56.8％、37.8％。胰腺癌SPARC基因甲基化率與正常、慢性胰腺炎比較均差別非常顯著(P<0.001),與癌旁比較差別不顯著。2.健康人白細胞、正常胰腺、慢性胰腺炎、胰腺癌及癌旁組織DNA中SARP2基因第一外顯子區(qū)CpG位點甲基化率分別為5.7％、0％、2.5％、37.9％、14.1％；胰腺癌組織與慢性胰腺炎、白細胞及正常胰腺胰組織比較CpG位點甲基化率差別非常顯

4、著(P<0.01),而與癌旁比較差別顯著(P<0.05)。并且這兩個基因均有部分CpG位點具有較高的甲基化率。3。在健康對照者、慢性胰腺炎及胰腺癌患者外周循環(huán)核酸中也能檢測到SARP2基因甲基化,其CpG位點平均甲基化化率分別為：2.2％、10.4％、16.0％,胰腺癌與健康對照組比較差別非常顯著(P<0.01),與慢性胰腺炎比較差別不顯著(P>0.05)。4.制備了SPARC基因甲基化標準品和內參ACTB標準品,初步建立了SPARC基

5、因實時定量檢測方法(QMT)。5.初步篩查出了部分胰腺癌高甲基化基因。 結論：1.胰腺癌SPARC、SPAR2基因第一外顯子區(qū)CpG位點具有較高的甲基化率,并且CpG位點甲基化的分布具有不均衡性,部分位點具有胰腺癌特異性,可作為胰腺癌基因診斷的靶點。2.在胰腺癌外周血循環(huán)核酸中可以檢測到甲基化異化的SARP2基因,因此循環(huán)核酸中甲基化異化基因的檢測可以用于胰腺癌的基因診斷。3.SPARC基因的甲基化實時定量檢測方法穩(wěn)定、敏感,可