RACK1蛋白與CLIC1蛋白的相互作用.pdf

1、目的：通過(guò)間接免疫熒光法,免疫共沉淀法,觀察在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中活化的蛋白激酶C受體1(RACK1)蛋白和氯離子胞內(nèi)通道1(CLIC1)蛋白的表達(dá)與定位,驗(yàn)證在體內(nèi)是否存在相互作用,利用GST-Pulldown法研究?jī)傻鞍自隗w外是否存在相互作用。
　　方法：設(shè)計(jì)RACK1的上下游引物,以RACK1的全長(zhǎng)cDNA序列為模板,PCR擴(kuò)增出RACK1序列,構(gòu)建到pCDNA3.1(+)真核表達(dá)載體和GST原核表達(dá)載體中。酶切鑒定正確的pCDN

2、A3.1-FLAG-RACK1、 pCDNA3.1-HA-RACK1及GST-RACK1重組質(zhì)粒送到生工公司測(cè)序。經(jīng) BLAST比對(duì),測(cè)序正確的pCDNA3.1-FLAG-RACK1或pCDNA3.1-HA-RACK1和pCDGFP-CLIC1分別轉(zhuǎn)染到 COS7細(xì)胞。觀察各自空間分布,再共轉(zhuǎn)染到 COS7細(xì)胞,觀察在 RACK1與CLIC1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的共定位情況。轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-FLAG-RACK1到HEK293T細(xì)胞,利用W

3、estern blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)情況,并與pCDGFP-CLIC1共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞,用免疫共沉淀驗(yàn)證兩者是否存在相互作用。GST-RACK1轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中,制備融合蛋白,同時(shí)轉(zhuǎn)染 pCDGFP-CLIC1到293T細(xì)胞通過(guò)GST-Pulldown技術(shù)檢測(cè)兩者在體外相互作用情況。
　　結(jié)果：酶切鑒定與公司測(cè)序的結(jié)果表明重組質(zhì)粒 pCDNA3.1-FLAG-RACK1、pCDNA3.1-HA-RACK1與 GST-

4、RACK1構(gòu)建成功。熒光顯微鏡檢測(cè) RACK1與CLIC1蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有分布,并且兩者在 COS7細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中存在重疊分布。Western blot法檢測(cè)到RACK1蛋白在239T細(xì)胞中表達(dá),免疫共沉淀法證明帶FLAG標(biāo)簽的RACK1蛋白可以把CLIC1蛋白沉淀下來(lái),在適當(dāng)濃度IPTG誘導(dǎo)下,GST-RACK1融合蛋白表達(dá)成功,GST-Pulldown實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了體外條件下RACK1蛋白能夠把CLIC1蛋白下拉下來(lái)。