Fractalkine對小鼠心肌缺血和缺血性心力衰竭的有害作用.pdf

1、背景與研究目的:
　　 不規(guī)則趨化因子(Fractalkine,FKN,CX3CL1)是新近發(fā)現(xiàn)的膜結合型趨化因子,主要表達于內皮細胞。越來越多研究表明FKN參與了多種炎癥性疾病的病生過程,例如動脈粥樣硬化、腎小球腎炎、腦缺血和冠狀動脈疾病。抑制FKN的表達被認為有益于炎癥性疾病,據報道FKN缺失小鼠腦缺血再灌注損傷程度較野生型小鼠明顯減輕,而采用高劑量的FKN抑制劑阿司匹林可以下調動脈粥樣硬化小鼠的FKN表達,并縮小動脈粥樣硬

2、化斑塊。在FKN受體和載脂蛋白E雙基因敲除小鼠,動脈粥樣硬化斑塊的形成明顯減輕。然而FKN在心肌缺血以及缺血性心力衰竭是否起作用,目前并不十分清楚。據我們所知,只有一項研究報道了在慢性心力衰竭(CHF)病人的血清可溶性FKN(s-FKN)水平上升,且與心衰的嚴重程度相關,而在心衰小鼠和CHF病人的心肌組織,FKN的表達水平也升高。我們假設s-FKN對心臟細胞有損害作用,抑制FKN的表達及其作用可能是治療心肌缺血和CHF的一項新的治療措施

3、。本研究的目的有以下幾點:(1)明確FKN的表達是否與心力衰竭的程度有關；(2)明確在正常狀態(tài)和缺血缺氧狀態(tài),FKN對心肌細胞,成纖維細胞和內皮細胞是否有損害作用；(3)己酮可可堿(PTX)和白藜蘆醇(RES)是否可以抑制FKN的作用；(4)在小鼠模型,抑制FKN是否有益于心肌缺血和缺血性心力衰竭。
　　 研究方法:
　　 1.cDNA基因芯片分析
　　 8周齡C57BL/6雄性小鼠,體重約20-25 g,予以主

4、動脈弓縮窄術或假手術。術后8周,采用不同心力衰竭程度的小鼠全心進行基因芯片譜分析。
　　 2.細胞培養(yǎng)和處理
　　 體外分離培養(yǎng)心肌細胞,心臟成纖維細胞和微血管內皮細胞,在FKN處理組中加入不同濃度的重組可溶性FKN(100,150和200 ng/ml),孵育24 h,而藥物處理組則在加入100ng/ml FKN前1 h,用白藜蘆醇和己酮可可堿預處理(PTX,1 ng/ml；RES,25 μM)。對照組包括了1個未予任何

5、處理組,2個藥物溶劑組(PBS和DMSO)。24 h后收集細胞分析心房肽(ANP)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)和細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的基因表達水平。
　　 3.缺氧復氧和氧化應激刺激心肌細胞
　　 通過建立缺氧復氧(A/R)細胞模型和過氧化氫(H2O2)誘導的氧化應激模型來分析:FKN對心肌細胞的作用。培養(yǎng)新生大鼠心肌細胞于96孔板(每孔1×105個細胞),實驗分組如下:(1)A/R組:心肌細胞置于厭氧

6、環(huán)境3 h,隨后復氧2 h；(2)A/R+s-FKN組(100,150和200 ng/ml):缺氧復氧結束后,加入不同濃度的可溶性FKN孵育12 h；(3)A/R+RES+s-FKN組:缺氧復氧結束后,加入RES(25 μM)預處理1 h,再加入FKN(100 ng/ml)孵育12 h。心肌細胞加入H2O2(100 μM)刺激6 h誘導氧化應激。6 h后,加入不同濃度的可溶性FKN(100,150和200 ng/ml)或RES 25 μ

7、M預處理1 h后再加入FKN 100 ng/ml,孵育12 h。采用MTT法進行細胞生存分析。
　　 4.心肌梗死和心力衰竭模型的建立
　　 11-12周齡C57BL/6雄性小鼠,體重約23-30 g,戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉。經胸骨左側第四肋間開胸,暴露心臟。以8-0尼龍線穿過左心耳下緣1-2 mm處的2/3心肌層,結扎左側冠狀動脈,誘導心肌梗死和隨后發(fā)生的心力衰竭。12 h后存活的小鼠隨機給與RES

8、治療或丙二醇(溶劑)42 d。假手術組小鼠同樣隨機給與RES治療或丙二醇。在心梗術后7,14,30和42 d不同的時間點,采用M型超聲對小鼠進行心功能的評估。測量左室收縮和舒張末期內徑(LVESd、LVEDd),計算左室短軸縮短率:LVFS=(LVEDd-LVESd)/LVEDd×100。用于蛋白分析的小鼠心臟保存于-80℃,用于免疫組化的小鼠心臟則置于4％多聚甲醛中固定,心臟切片約4-6 μm,包埋于石蠟。實驗分4組:假手術組,假手術

9、+RES組,心梗組,心梗+RES組,每組10-12只。
　　 5.小鼠心臟Langendorff模型的制備
　　 C57BL/6雄性小鼠(11-12周齡),腹腔內注射肝素(2.5 U/g)使之肝素化,20 min后腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg),開胸于1 min內在距主動脈根部約2mm處,用20號注射器針頭插入升主動脈,用動脈央固定后切斷主動脈及心臟周圍的血管、軟組織,迅速取出心臟,置于心臟的灌流裝置上,絲線固定

10、。Krebs-Henseleit(K-H)灌流預平衡20 min,關閉灌流開關,全心缺血40 min后,K-H液再灌注。分析ANP、MMP.9和ICAM-1的mRNA表達情況的實驗分為以下4組,每組3只:
　　 1.對照組(K-H液灌注220min)
　　 2.IR組(缺血再灌注組,缺血40min,K-H液再灌注180min)
　　 3.IR+FKN組(缺血40 min,含s-FKN 50 ng/ml的K-H液再

11、灌注180 min)
　　 4.IR+RES+FKN組(缺血40 min,含RES 25 μM和s-FKN 50 ng/ml的K-H液再灌注180min)
　　 實驗結束后,用于RNA分析的心臟保存于RNA保存液中。
　　 心肌梗死面積評估的實驗分組如下,每組4只:
　　 1.對照組(K-H液灌注100 min)
　　 2.IR組(缺血40 min,K-H液再灌注60 min)
　　 3.

12、IR+FKN組(缺血40 min,含s-FKN 50 ng/ml的K-H液再灌注60 min)
　　 4.IR+RES組(缺血40 min,含RES 25 μmol/L的K-H液再灌注60 min)
　　 5.IR+RES+FKN組(缺血40 min,含RES 25 μM和s-FKN 50 ng/ml的K-H液再灌注60 min)
　　 結論:
　　 1.心力衰竭時,心肌FKN表達水平明顯上調,心肌FKN

13、的表達水平與心力衰竭的嚴重程度呈正相關,提示了FKN可作為一個新的心力衰竭分子標志物。
　　 2.FKN可以降低心肌細胞生存率,促進心臟纖維化,激活血管內皮細胞和增加心肌梗死面積,對心臟細胞存在損害作用,其損害作用是心肌缺血和缺血性心力衰竭的部分病理生理機制。
　　 3.白藜蘆醇既可以抑制FKN的產生,還可以抑制s-FKN對心臟的損害作用,從而改善缺血性心力衰竭小鼠的生存率、心功能和減輕心室重塑,提示抑制FKN的表達及其