惡性胸腔積液中肺腺癌的耐藥相關(guān)基因的表達(dá)及臨床意義.pdf

1、目的
　　探討ERCC1、TYMS、RRM1、TUBB3、NonmuscleMyosinⅡ、Myoglobin、MyoD1在惡性胸腔積液的肺腺癌中的表達(dá)的分子生物學(xué)意義以及確定對(duì)以鉑類(lèi)為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療的晚期患者的預(yù)后價(jià)值。
　　材料與方法
　　1、臨床樣本
　　收集2011到2012年中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院門(mén)診及病房胸腔積液，優(yōu)選以癌細(xì)胞為主炎癥細(xì)胞較少的，未接受過(guò)治療的116例肺腺癌患者惡性胸腔積液作為研究對(duì)

2、象，經(jīng)細(xì)胞病理診斷及組織水平核實(shí)和免疫化學(xué)染色診斷為肺腺癌，另20例炎性胸水作為良性對(duì)照。6例肺腺癌穿刺樣本。這116例中男47例，，女69例，年齡從26至87歲，平均年齡為57歲，并對(duì)50例患者進(jìn)行了隨訪調(diào)查，生存期自確診日至死亡時(shí)間或2013年4月末，中位隨訪時(shí)間為18個(gè)月(15-28個(gè)月)，其中48均接受以鉑類(lèi)為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，2例失訪。
　　2、液基細(xì)胞薄層檢測(cè)技術(shù)（ThinPrepCytologyTest，TCT）

3、>　　收集新鮮胸水25ml左右，室溫下2000r/min離心5分鐘，棄去上清液，加入清洗液再次離心后，棄去上清液，取底層沉淀細(xì)胞與保存液混合后，機(jī)器Thinprep5000自動(dòng)制片，并進(jìn)行染色和鏡下診斷。
　　采用TCT常規(guī)制片，診斷后，每份標(biāo)本收集新鮮胸水200ml左右，室溫下2000r/min離心5分鐘，經(jīng)95％乙醇固定12小時(shí)后石蠟包埋，切片，HE染色后，鏡下觀察，篩選切片。肺穿刺組織標(biāo)本經(jīng)固定，石蠟包埋并制成切片。

4、　　3、免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)
　　采用鏈霉素抗生物素-過(guò)氧化酶（streptavidin-peroxidase，SP）法，PBS緩沖液代替一抗作為空白對(duì)照，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封片。CK7、TTF-1、vimentin一抗采自美國(guó)SantaCruz公司，ERCC1、TYMS、RRM1、TUBB3、NonmuscleMyosinⅡA、Myoglobin、MyoD1一抗采自美國(guó)abcam公司。
　　免疫

5、化學(xué)染色結(jié)果判定:陽(yáng)性染色為細(xì)胞漿或細(xì)胞核有棕黃色顆粒，切片中觀察5個(gè)高倍鏡視野(200×)，計(jì)算5個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞的平均百分?jǐn)?shù)，陽(yáng)性染色細(xì)胞＜5％為陰性，≥5％為陽(yáng)性。
　　4、免疫熒光染色
　　石蠟包埋切片，經(jīng)脫蠟，脫苯和水化后高溫高壓抗原修復(fù)，加一抗，4℃過(guò)夜，PBS洗三遍，每次5分鐘，加入二抗室溫避光孵育2h。PBS洗四遍，每次五分鐘。加入0.5μg/mlDAPI(PBS配制)染色10分鐘，用PBS洗三遍，去除多余的

6、DAPI?？顾p熒光封片劑封片，顯微鏡觀察，照相。
　　5、Western-Blotting檢測(cè)
　　對(duì)惡性胸腔積液進(jìn)行收集，放到-70℃冰箱凍存，良性胸水用于做陰性對(duì)照?？偟鞍讖氖占男厮?xì)胞中提取，用Brodford法測(cè)定蛋白濃度，蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5％脫脂奶粉封閉液封閉2h，一抗(1∶500)4℃過(guò)夜，后用TTBS洗膜，二抗室溫孵育2小時(shí)，TTBS洗膜，Thermo試劑盒發(fā)光。以β-a

7、ctin為內(nèi)參，用凝膠成像及分析系統(tǒng)(BiolmagingSystems，美國(guó))分析蛋白各條帶的灰度值。所用抗體與免疫化學(xué)染色所用的抗體自同一公司。
　　6、統(tǒng)計(jì)分析
　　統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，基因表達(dá)與臨床特征之間的關(guān)系采用chi-squaretest或者Fisher'sexacttest。不同基因間蛋白表達(dá)水平相關(guān)性采用Spearmancorrelationcoefficients.TheKaplan

8、-Meiermethod和Log-ranktest用于分析患者生存期與基因表達(dá)的關(guān)系。MultivariateCoxregressionanalysis用于分析年齡，性別與生存期的關(guān)系。P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果
　　在116例惡性胸腔積液中ERCC1的表達(dá)率為37％，TYMS的表達(dá)率為36.2％，RRM1的表達(dá)率為82.7％，TUBB3的表達(dá)率為69.8％。50例中NonmuscleMyosinⅡ的表達(dá)率為48

9、％，Myoglobin的表達(dá)率為40％，MyoD1的表達(dá)率為38％。6例肺穿刺樣本MyoD1免疫組織化學(xué)染色均為陰性。MyoD1的細(xì)胞免疫熒光染色定位核陽(yáng)性。七種基因之間的表達(dá)具有良好的相關(guān)性。具有各基因陽(yáng)性表達(dá)的患者其生存期短于陰性表達(dá)的患者。
　　結(jié)論
　　ERCC1、TYMS、RRM1、TUBB3、NonmuscleMyosinⅡ、Myoglobin、MyoD1的表達(dá)能夠影響采用以鉑類(lèi)為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療為治療方案患者的生