HCV IRES翻譯啟動活性的細胞特異性及其機制研究.pdf

1、目的：HCV5’端非編碼區(qū)含內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)，其功能主要是調控病毒基因復制和以非帽依賴方式啟動翻譯病毒蛋白，而且HCV5'UTR在不同基因型和株中呈現(xiàn)高度的序列保守，這也使它成為了抗病毒藥物研發(fā)的良好靶位。本實驗旨在研究在不同宿主細胞的翻譯體系下，缺失不同結構域的HCV5’UTR翻譯啟動活性的差異，并探索其機制。
　　 方法：⑴以脂質體介導基因轉染技術，將HCV5’UTR缺失不同結構域并調控Fluc的真核表達質粒與

2、調控Rluc的真核表達質粒pRL-TK共轉染至不同的細胞中，轉染后36h。提取細胞RNA進行半定量RT-PCR檢測，利用質粒pRL-TK校正其它質粒的轉染效率；用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測Fluc基因相對表達活性，分析HCV5’UTR缺失不同結構域后在不同翻譯體系中翻譯啟動活性的差異。⑵選擇同種細胞中活性差異較大的缺失HCV5’UTR不同結構域的質粒進行體外轉錄，獲得RNA，使之與細胞蛋白質進行特異性結合，以篩選出特異性的結合蛋白。

3、
　　 結果：①缺失HCV5’UTR的DomainⅠ及下游的單鏈序列后，HCV IRES的活性分別與缺失前相比：在Hela細胞和C6細胞中無明顯影響，在L-02細胞中活性下降為46％，而在293T細胞則為缺失前的146％。②缺失HCV5’UTR的DomainⅡ后，HCV IRES的活性分別與缺失前相比：在Hela細胞中，缺失后活性僅為缺失前的49％，而在L-02細胞、C6細胞和293T細胞中，活性分別為缺失前的140％、160％

4、和235％。③體外轉錄出了缺失HCV5’UTR不同結構域的RNA，并分離出了能與其特異性結合的蛋白質。
　　 結論：⑴HCV5'UTR的DomainⅠ對HCV IRES在L-02細胞株中的翻譯啟動活性具促進作用，而在293T細胞株中有抑制作用，在C6細胞株和Hela細胞株中DomainⅠ對IRES翻譯啟動活性無明顯作用。⑵HCV5'UTR的DomainⅡ對HCV IRES在Hela細胞株中的翻譯啟動活性有促進作用，而對其他三種細