鈣離子-鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ抑制物1(CAMK 2N1)對前列腺癌抑制作用的實驗研究.pdf

1、本文分三部分進行介紹：
　　第一部分
　　CAMK2N1真核表達載體的擴增、測序鑒定及體外表達驗證
　　目的：
　　擴增 CAMK2N1真核表達載體(pCMV6-AC-GFP-CAMK2N1質(zhì)粒)并進行測序鑒定。將 pCMV6-AC-GFP-CAMK2N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌細胞系 PC3細胞后驗證過表達 CAMK2N1的效果,為后續(xù)實驗在 PC3細胞中過表達 CAMK2N1蛋白提供保證。
　　方法：
　

2、　(1)將 pCMV6-AC-GFP-CAMK2N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞,擴增后提取質(zhì)粒,進行 DNA測序,與基因庫序列進行比對;
　　(2)體外培養(yǎng)前列腺癌細胞系 PC3細胞,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pCMV6-AC-GFP-CAMK2N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至 PC3細胞,24h后采用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)法以及免疫印跡法(Western blotting)檢測 CAMK2N1的表達變化。
　　結(jié)果：
　　(1)成功擴增 pC

3、MV6-AC-GFP-CAMK2N1質(zhì)粒,經(jīng)測序鑒定載體所攜帶的CAMK2N1 ORF序列準確無誤;
　　(2) pCMV6-AC-GFP-CAMK2N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 PC3細胞后,能在 mRNA水平以及蛋白水平上調(diào) CAMK2N1的表達。
　　結(jié)論：
　　pCMV6-AC-GFP-CAMK2N1質(zhì)粒能在真核細胞內(nèi)成功表達 CAMK2N1-GFP融合蛋白,為下一步使用該載體在前列腺癌細胞內(nèi)過表達 CAMK2N1蛋白奠定了基

4、礎(chǔ)。
　　第二部分
　　過表達 CAMK2N1對前列腺癌細胞生長抑制作用的體外研究
　　目的：
　　將 pCMV6-AC-GFP-CAMK2N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的前列腺癌細胞系 PC3細胞,上調(diào) CAMK2N1蛋白的表達后,檢測對 PC3細胞生長曲線、增殖率、細胞周期、凋亡率、細胞侵襲性的影響。
　　方法：
　　前列腺癌 PC3細胞培養(yǎng)于含10％(體積分數(shù))胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中,置于含5

5、％ C02的37℃培養(yǎng)箱中。將細胞分為三組:空白組、對照組、實驗組,處理方式分別為不加干預(yù)、轉(zhuǎn)染 pCMV6-AC-GFP空載體、轉(zhuǎn)染pCMV6-AC-GFP-CAMK2N1質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染采取脂質(zhì)體法(Lipofectamine2000)。轉(zhuǎn)染24h后,采用細胞計數(shù)試劑盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)檢測各組細胞的生長情況,繪制生長曲線;EdU(5-ethynyl-2’-deoxyuridine)核素摻入法檢測細

6、胞增殖率;流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布、細胞凋亡率;Transwell小室法檢測細胞侵襲力。
　　結(jié)果：
　　與空白組和對照組相比,實驗組上調(diào) CAMK2N1的表達后,細胞生長受到抑制,細胞增殖率下降,細胞周期分布中G0/G1期細胞比例增大,細胞侵襲性降低。各組細胞凋亡率未見明顯差異。
　　結(jié)論：
　　通過轉(zhuǎn)染 pCMV6-AC-GFP-CAMK2N1質(zhì)粒后上調(diào) CAMK2N1的表達,能抑制PC3細胞生長,降低細胞

7、增殖率,誘導(dǎo) G0/G1期細胞阻滯,并且降低細胞侵襲性。在體外實驗證實了CAMK2N1具有腫瘤抑制作用。
　　第三部分
　　CAMK2N1在前列腺癌組織中的表達以及與臨床病理特征相關(guān)性的研究
　　目的：
　　檢測 CAMK2N1蛋白在前列腺癌組織中的表達情況,并分析 CAMK2N1的表達與前列腺癌臨床病理特征之間的聯(lián)系。
　　方法：
　　收集2007年10月～2011年4月武漢同濟醫(yī)院病理科存檔前列腺

8、組織標本78例,分成三組:前列腺癌組(n=34),良性前列腺增生(BPH)組(n=28),正常前列腺組(n=16)。應(yīng)用免疫熒光法檢測 CAMK2N1在前列腺組織中的表達定位,免疫組化法檢測 CAMK2N1、Ki-67以及p27 Kip1在前列腺癌中的表達水平并作定量分析。收集前列腺癌患者的相關(guān)臨床病理資料,包括術(shù)前前列腺特異性抗原(PSA)水平、前列腺外侵犯情況、臨床分期、病理分級、Gleason評分等,分析 CAMK2N1的表達與臨

9、床病理特征之間的聯(lián)系。
　　結(jié)果：
　　(1)CAMK2N1在前列腺癌組、BPH組和正常前列腺組中均有表達,表達定位于細胞漿;
　　(2)前列腺癌組 CAMK2N1的表達水平顯著低于 BPH組和正常前列腺組,并且CAMK2N1的表達水平與前列腺外侵犯、臨床分期、病理分級、Gleason評分呈負相關(guān),與患者術(shù)前 PSA水平無顯著關(guān)系;
　　(3)CAMK2N1的表達水平與 Ki-67呈負相關(guān),與 p27 Kip1呈