Tg737基因在胎肝干細胞分化過程中的作用及機制研究.pdf

1、胎肝干細胞具有能分化為肝細胞和膽管上皮細胞的特點,為基礎研究和臨床應用搭建了更寬闊的平臺,干細胞治療各類肝臟疾病的構想和實踐與再生醫(yī)學的理念不謀而合,其前景是光明遠大的。同時大量的研究表明干細胞與腫瘤干細胞有著微妙的聯系,干細胞的分化異?？赡軐е聬鹤?甚至引發(fā)腫瘤。因此,正反兩個方面都說明了探究胎肝干細胞正常分化過程中受到哪些關鍵分子、蛋白抑或信號通路的調控及其潛在機制的重要性和必要性。
　　目的:
　　本研究以胎肝干細胞的

2、正常分化為切入點,擬初步探索Tg737基因在胎肝干細胞分化過程中所起的作用及其潛在的分子機制。研究內容分為兩部分:1、Tg737基因在胎肝干細胞分化過程中的表達及作用;2、初步探討Tg737基因調控胎肝干細胞分化的機制。
　　方法:
　　1.三步分離法收集胎肝干細胞;HGF(20ng/ml)誘導胎肝干細胞一周,選取第1、3、5、7天定為后續(xù)實驗的檢測點,PCR連續(xù)監(jiān)測ALB和AFP的mRNA表達變化;在上述4個時間點,Wes

3、tern blot連續(xù)監(jiān)測Tg737蛋白的表達變化;慢病毒Tg737-shRNA轉染胎肝干細胞,分為實驗組和對照組,PCR、Western blot檢測沉默效果;流式細胞術連續(xù)檢測兩組細胞的CD133表達變化;PCR連續(xù)監(jiān)測兩組細胞ALB和AFP的表達變化;在培養(yǎng)第7天,透射電鏡觀察兩組細胞的超微結構差異。
　　2.PCR、Western blot連續(xù)監(jiān)測HNF4α在正常胎肝干細胞分化過程中的表達變化;在培養(yǎng)第7天以Western

4、 blot、PCR檢測實驗組和對照組細胞中HNF4α蛋白和mRNA的表達情況;免疫熒光技術檢測兩組細胞中β-catenin的表達情況;Western blot檢測兩組細胞中Snail蛋白的表達情況。
　　結果:
　　1.三步分離法能有效富集胎肝干細胞;在HGF(20ng/ml)誘導正常胎肝干細胞的第1、3、5、7天,AFP的mRNA表達逐漸降低,ALB的mRNA表達逐漸升高;在誘導分化過程中,Tg737的蛋白表達逐漸升高;慢

5、病毒-shRNA能有效下調Tg737的mRNA和蛋白表達;在HGF誘導分化過程中,流式細胞技術檢測兩組細胞CD133的表達,發(fā)現在第1天,二者的表達無顯著差異,隨著誘導的進行,相比對照組,實驗組CD133表達的下降更緩慢,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05);實驗組AFP和ALB的mRNA水平均無明顯變化(p>0.05);在第7天以透射電鏡觀察兩組細胞的超微結構:實驗組的細胞核大且富含異染色質,胞質稀疏且細胞器極少,核質比大,細胞表面絨毛的

6、數量稀少;對照組細胞的核質比很低,細胞都已極化,細胞質中含有大量的線粒體、溶酶體、發(fā)育良好的高爾基體等細胞器,顯示出早期分化的特點。
　　2.在HGF(20ng/ml)誘導正常胎肝干細胞分化的第1、3、5、7天,PCR、Western blot連續(xù)監(jiān)測提示:HNF4α的mRNA和蛋白水平都逐漸增加(p<0.05);相比對照組,實驗組HNF4α的mRNA和蛋白水平都顯著下調(p<0.05),核內的β-catenin表現出更強的免疫反

7、應性即Wnt/β-catenin呈過度激活表現,Snail蛋白表達上調。
　　結論:
　　1.三步分離法能有效富集胎肝干細胞,HGF(20ng/ml)能有效誘導胎肝干細胞向正常肝細胞分化。
　　2.Tg737基因參與調控胎肝干細胞向正常肝細胞的分化,抑制Tg737的表達導致胎肝干細胞分化受阻。
　　3.HNF4α參與胎肝干細胞的正常分化過程;Tg737基因的缺失導致HNF4α表達下調,Wnt/β-catenin信