抗過敏藥物異丙嗪加重清開靈注射液致心律失常作用的研究.pdf

1、目的:
　　清開靈注射液發(fā)生嚴重不良反應時，常用抗過敏藥物異丙嗪來進行治療。已有臨床前及臨床數(shù)據(jù)研究證明，清開靈能導致潛在的心律失常，本研究對抗過敏藥物異丙嗪用于搶救清開靈注射液引起的嚴重不良反應患者的方案提出了質疑，通過臨床前的心臟安全性評價實驗，來驗證異丙嗪可加重清開靈注射液所致的緩慢性心律失常作用。
　　藥品:
　　1.清開靈:清開靈注射液(QKL)，批號:11040664，國藥準字Z13020880，河北神威藥

2、業(yè)有限公司生產。
　　2.異丙嗪:異丙嗪鹽酸鹽(Promethazine，PMZ)，批號:1001154582，是從Sigma-aldrich公司購買。
　　方法:
　　1.豚鼠在體心電圖記錄:
　　20％烏拉坦(5mL/kg)對豚鼠進行腹腔注射麻醉，以仰臥位進行固定，分離出一側頸靜脈，進行插管，再給藥。四肢皮下扎入針形電極引導記錄Ⅱ導聯(lián)心電信號，經四道生理記錄儀采樣并存入計算機。于靜脈推注藥物5 min后記錄心

3、電圖，分析心率、P-R間期、QRS間期和QTc間期。
　　按照清開靈注射液說明書所規(guī)定的:成人用量為每次40 ml，在體實驗采用40ml為1倍臨床劑量。按國際標準豚鼠用劑量為人用劑量的4.6倍，換算為豚鼠在體1倍劑量為3.1 ml/kg。按照注射用異丙嗪鹽酸鹽說明書所規(guī)定的:抗過敏用量每次25 mg，最高量不得超過每次100mg，在體實驗中采用臨床最高用量100 mg/60 kg為1倍臨床劑量。同樣按國際標準換算為豚鼠在體1/2倍

4、劑量為3.83 mg/kg，1倍劑量為7.67 mg/kg，2倍劑量為15.33 mg/kg，5倍劑量為38.35 mg/kg。
　　2.豚鼠離體心電圖記錄:
　　采用改進的Langendoff灌流系統(tǒng)，經主動脈進行離體心臟灌流，心臟復跳后在心外膜下置3根銀絲電極:正極置于心尖處，負極置于右心房，接地電極置于主動脈根部，引導出離體心臟心電圖。待豚鼠心臟跳動穩(wěn)定后，信號經四道生理記錄儀輸入計算機記錄，分析心率、P-R間期、QR

5、S間期和QTc間期。
　　清開靈注射液的說明書規(guī)定成人用量為40 ml。按成人體重60 kg為例計算;成人細胞外液約為12000ml(按體重的20％算)，因此換算成臨床血藥濃度即為3.3 ml/L。據(jù)上述方法換算后，離體實驗的組織和細胞灌流液1倍臨床濃度為3.3 ml/L，10倍臨床濃度為33 ml/L。根據(jù)之前的預實驗可得知，單獨異丙嗪實驗，采用的濃度為0.1、1、10和50μmol/L，與清開靈合用時采用1、10、30和50μ

6、mol/L。
　　3.豚鼠乳頭肌動作電位記錄:
　　用20％烏拉坦(5 mL/kg)對豚鼠進行腹腔注射麻醉后，快速開胸取出心臟，置于0～4℃無鈣灌流液中使之停搏，修剪，取出左心室乳頭肌1條，將其固定于恒溫浴槽底部。充以95％ O2+5％ CO2飽和的含鈣臺氏灌流液，在恒溫(36±0.5℃)下以5ml/min的速度恒速灌流，標本在浴槽內穩(wěn)定1小時后進行實驗。給予強度為1.5倍閾值，波寬10 ms，刺激頻率1Hz的方波刺激。信號

7、經四道生理記錄儀輸入計算機記錄。
　　4.大鼠左心室肌細胞L型鈣電流記錄:
　　采用改良的酶解法分離獲取大鼠單個心室肌細胞。采用膜片鉗全細胞記錄方法，在室溫(20-22℃)下進行。將細胞懸液數(shù)滴加入倒置顯微鏡上的灌流槽中(RC-26，Recording Chamber150μL，USA)，細胞貼壁后，用電流記錄外液灌流。選取邊緣無卷曲，橫紋清晰，表面無顆粒，無收縮的細胞進行封接實驗。玻璃毛細管(Sutter instrume

8、ntO.D.1.5mm，I.D.1.1 mm with filament)經微電極拉制儀制成尖端直徑約為1μm的電極，電極充灌電流記錄內液后，入水阻抗約為5 MΩ。調節(jié)三維操縱器使電極尖端移向細胞表面進行封接，阻抗達到1 GΩ以上后補償快電容，并給予負壓破膜形成全細胞記錄模式，調節(jié)慢電容補償和串聯(lián)電阻補償，以減少瞬時充放電電流和鉗制電位誤差。鉗制電壓為-80 mV，階躍到-40 mV并維持200 ms（使Na+電流失活），然后施加到0m

9、V、300 ms的試驗電壓。在電壓鉗制模式下，記錄用藥前后L型鈣通道的變化。
　　無鈣灌流液(mmol/L):NaCl117，KCl5.7，NaHCO34.4，NaH2PO41.5，MgCl21.7,HEPES20, Glucose20,Taurine10, pH用NaOH調至7.4。
　　KB液組成為為(mmol/L): L-glutamic acid50，KCl40，KH2PO420, Taurine20,MgCl2·6

10、H2O3, KOH70, EGTA0.5, HEPES10, Glucose10.pH用NaOH調至7.4。
　　電極記錄外液組成為(mmol/L): NaCl132，CsCl5.4，CaCl21.8，MgCl2·6H2O1.8,NaH2PO4·2H2O0.6,4AP5,HEPES10, glucose·H2O10, Na-pyruvate5.pH用NaOH調至7.4。
　　電極記錄內液組成為(mmol/L): CsCl13

11、0， MgCl2·6H2O2，EGTA11, HEPES20,glucose·H2O10, Na2ATP2,GTP0.1.pH用NaOH調至7.4。
　　5.全細胞電壓鉗記錄hNav1.5電流:
　　合成的hNav1.5 cDNA(NM_000335.4)被克隆到帶有G418耐藥性表達載體pcDNA3.1。構成的質粒在脂質體2000轉染試劑作用下，轉染至HEK(human embryokidney)細胞系中。在Dulbecc

12、o's改進的Eagle培養(yǎng)基上培養(yǎng)（10％小牛血清和250μg/ml G418) hNav1.5細胞株，通過規(guī)范的次代培養(yǎng)以維持最適宜的狀態(tài)用于hNav1.5電流記錄。
　　采用膜片鉗全細胞記錄方法，在室溫(20-22℃)下進行。
　　鉗制電壓為-80 mV，階躍到-20 mV維持20 ms。電流信號經膜片鉗放大器放大并經數(shù)字-信號轉換器與計算機對話，信號的發(fā)放和采集均由pClamp10.0軟件完成。
　　記錄外部溶液

13、(mmol/L): NaCl25、TEACl122、MgCl21、Glucose10、HEPES10、CaCl21.8，pH用NaOH調至7.4，滲透壓值用sucrose調至290 mOsm。
　　記錄內部溶液(mmol/L): CsF129、MgCl22、EGTA11、HEPES10、Na2ATP3、pH用CsOH調至7.2，滲透壓值用sucrose調至290 mOsm。
　　6.全細胞電壓鉗記錄hERG電流:
　　

14、合成的hERG cDNA(NM_000238.2)被克隆到帶有G418耐藥性表達載體pcDNA3.1。構成的質粒在脂質體2000轉染試劑作用下，轉染HEK(human embryo kidney)細胞系中。在Dulbecco's改進的Eagle培養(yǎng)基上培養(yǎng)（10％小牛血清和250μg/ml G418）hERG細胞株，通過規(guī)范的次代培養(yǎng)以維持最適宜的狀態(tài)用于hERG電流記錄。
　　采用膜片鉗全細胞記錄方法，在室溫(20-22℃)下進

15、行。鉗制電壓為-80 mV，階躍到-50 mV維持50 ms，然后施加到50 mV4800 ms試驗電壓，最后施加到-50 mV5000 ms試驗電壓。電流信號經膜片鉗放大器放大并經數(shù)字-信號轉換器與計算機對話，信號輸入經過1kHz的濾波，信號的發(fā)放和采集均由pClamp10.0軟件完成。
　　結果:
　　1.異丙嗪及合用清開靈注射液對豚鼠在體心電圖的影響:
　　清開靈注射液在3.1 ml/kg和15.5 ml/kg時

16、，對豚鼠在體心電圖的P-R、QRS、QTc間期及心率(P＞0.05)未能有顯著改變;在清開靈注射劑31 ml/kg和93 ml/kg時，呈劑量依賴性的延長豚鼠的QRS間期及QTc間期，而且清開靈注射液93 ml/kg時還能顯著性地延長P-R間期(P＜0.05)。對于異丙嗪而言，3.83 mg/kg（1/2臨床劑量）和7.67mg/kg（1倍臨床劑量）沒有明顯改變豚鼠在體心電圖的心率、P-R、QRS以及QTc間期(P＞0.05);異丙嗪1

17、5.33 mg/kg（2倍臨床劑量）顯著的延長了QRS間期;異丙嗪38.35 mg/kg（5倍臨床劑量），顯著減慢心率以及延長P-R、QRS以及QTc間期。清開靈注射劑31 ml/kg時能顯著延長豚鼠心電圖的QRS間期以及QTc間期，當清開靈注射劑31 ml/kg合用異丙嗪38.35 mg/kg劑量時，能進一步延長清開靈注射液以及清開靈注射液合用7.67 ml/kg作用下的P-R、QRS以及QTc間期，而且對豚鼠心率有顯著性減慢的作用(

18、P＜0.05)。
　　2.異丙嗪及合用清開靈注射液對豚鼠離體心電圖的影響:
　　33 ml/L的清開靈注射液顯著地延長QRS間期(P＜0.05);清開靈注射劑在66和99 ml/L時顯著減慢心率并顯著延長P-R，QRS間期(P＜0.05)，而且在99 ml/L時還能顯著延長其QTc間期(P＜0.05)。對于異丙嗪而言，濃度為10μmol/L時明顯減慢離體豚鼠心臟心率(P＜0.05)及延長QRS間期;50μmol/L的異丙嗪能

19、明顯減慢豚鼠心臟心率而且顯著延長QRS間期和QTc間期(P＜0.05)。當選用33 ml/L清開靈注射液作為基礎濃度，再合用1、10、30、50μmol/L的異丙嗪，心率出現(xiàn)不同程度濃度依賴性減慢，還進一步延長了清開靈作用下的P-R間期、QTc以及QRS間期(P＜0.05)。再用清開靈33 ml/L進行洗脫后，各參數(shù)會出現(xiàn)部分恢復。
　　3.異丙嗪及合用清開靈注射液對豚鼠乳頭肌動作電位的影響:
　　單獨灌流99μl/ml的清

20、開靈注射液，豚鼠的左心室乳頭肌的動作電位未見消失，而濃度達到165μl/ml時動作電位部分消失。對于異丙嗪而言，濃度為26μmol/L時，未出現(xiàn)動作電位消失。而當清開靈注射液99μl/ml合并異丙嗪10μmol/L時，動作電位就能出現(xiàn)部分的消失。同時再進行灌流液洗脫后，發(fā)現(xiàn)動作電位又可以恢復到正常。這就表明異丙嗪和清開靈注射液合用時，是加重了清開靈注射液抑制動作電位的形成。
　　4.異丙嗪及合用清開靈注射液對大鼠左心室肌細胞L型鈣

21、電流的影響:
　　清開靈注射液呈劑量依賴性的阻滯大鼠心室肌細胞L型鈣電流，抑制其L型鈣電流50％濃度(IC50)為52.2±10.9 ml/L。異丙嗪對大鼠心室肌細胞的L型鈣電流也有抑制作用，抑制其的50％濃度(IC50)是9.2±1.3μmol/L。異丙嗪在清開靈3.3 ml/L存在的條件下，抑制大鼠L型鈣電流50％濃度(IC50)為7.0±1.0μmol/L，兩組之間存在顯著性差異。
　　5.異丙嗪及合用清開靈注射液對h

22、Nav1.5電流的影響:
　　異丙嗪濃度依賴性地抑制了hNav1.5電流，其IC50為6.4±1.4μmol/L。異丙嗪在清開靈3.3 ml/L存在條件下，抑制hNav1.5電流50％濃度(IC50)為4.0±0.4μmol/L，兩組之間存在顯著性差異。
　　6.異丙嗪及合用清開靈注射液對hERG電流的影響:
　　異丙嗪可計量依賴性的阻滯hERG電流，抑制hERG電流50％的濃度(IC50)為1.6±0.2μmol/L

23、。異丙嗪在清開靈3.3 ml/L存在的條件下，其抑制hERG電流50％濃度(IC50)為1.0±0.2μmol/L，兩組之間存在顯著性差異。
　　結論:
　　1.豚鼠心臟的在體和離體實驗能確證清開靈注射液能穩(wěn)定的誘發(fā)緩慢性心律失常。
　　2.在豚鼠心臟的在體實驗中，異丙嗪有減慢其心律失常的作用。在離體乳頭肌的實驗中可以使動作電位部分消失。同時對大鼠心室肌細胞L型鈣電流、hNav1.5以及hERG電流都呈濃度依賴性的抑制

24、，其IC50分別為9.2±1.3μmol/L、6.4±1.4μmol/L、1.6±0.2μmol/L。
　　3.異丙嗪與清開靈注射液的合用并沒有起到救治作用，反而加重了清開靈注射液減慢心率以及顯著延長P-R間期以及QRS間期和QTc間期的作用，進一步加重清開靈致緩慢性心律失常的作用。
　　4.異丙嗪在清開靈3.3 ml/L的存在條件下，對大鼠心室肌細胞L型鈣電流、hNav1.5以及hERG電流都呈濃度依賴性的抑制，IC50分