轉染IDO基因的樹突細胞及色氨酸代謝產物抑制移植排斥反應的體外實驗.pdf

1、目的：探討轉染吲哚胺2，3-雙加氧酶(indoleamine2，3-dioxygenase，IDO)基因并獲得高表達的小鼠骨髓來源成熟樹突狀細胞(DendriticCell，DC)聯(lián)合色氨酸代謝產物對同種異系T淋巴細胞增殖的影響，為臨床預防器官移植排斥反應，成功誘導移植后免疫耐受開辟新途徑。
　　方法：(1)應用RT-PCR技術從小鼠附睪中擴增IDO基因序列，構建IDO真核表達載體pEGFP-N1-IDO質粒。(2)采用培養(yǎng)基細胞

2、因子選擇法體外培養(yǎng)小鼠骨髓來源DC，流式細胞儀檢測DC表面抗原CD80、CD86、MHCⅡ、CD11c的表達情況。(3)利用脂質體介導法使pEGFP-N1-IDO質粒轉染小鼠成熟DC，倒置熒光顯微鏡下觀察轉染后DC中綠色熒光蛋白的表達，RT-PCR及免疫細胞化學法分別在mRNA和蛋白水平檢測IDO的表達。(4)免疫磁珠法陽性分選同種異系小鼠脾臟CD4+T淋巴細胞，流式細胞儀檢測CD4+T淋巴細胞的陽性率。(5)以轉染IDO基因的DC作為

3、刺激細胞，小鼠脾臟CD4+T淋巴細胞作為反應細胞行單向混合淋巴細胞培養(yǎng)，同時增加培養(yǎng)基中色氨酸產物的量，MTT法檢測CD4+T淋巴細胞的增殖情況。使用SPSS17.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析。
　　結果：(1)成功構建含小鼠IDO基因的真核表達載體pEGFP-N1-IDO質粒，并轉染DC獲得表達。(2)經體外培養(yǎng)，每只小鼠可獲得5-6×106個具備典型樹突狀結構的骨髓來源DC，其表面高表達CD80(97.7％)、CD86(83.6％)、

4、MHC-Ⅱ(94.6％)、CD11c(87.9％)。(3)免疫磁珠法可分選出純度達90％以上的CD4+T細胞。(4)IDO+DC組及IDODC+色氨酸產物(KYN、3-HK、3-HAA)組均明顯抑制CD4+T細胞增殖，而IDO+DC+色氨酸產物組較前兩者對其增殖抑制更顯著(P<0.001)。其中以3-HAA的作用最明顯，所需濃度最低。轉染IDO質粒的DC與色氨酸代謝產物對CD4+T細胞的增殖抑制具有疊加作用。
　　結論：高表達ID