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文檔簡介
1、大量研究表明不良刺激可增加子代罹患心血管疾病的風險??Х?、茶、可樂等含相當量咖啡因,咖啡因可通過直接影響肌細胞的收縮性而影響心血管功能。隨著含咖啡因食品的普及,孕期咖啡因暴露對子代心血管的影響雖日益受到關注,但相關研究很少,多為在體水平,針對胎兒或者新生兒的血流動力學指標進行監(jiān)測,極少有研究涉及子代出生后至成年過程中的心血管發(fā)育的“程序化調(diào)控”,尤其涉及離子通道機制的研究未見報導。
本課題重點運用膜片鉗技術,激光共聚焦,同步動
2、態(tài)監(jiān)測微動脈直徑和血管細胞內(nèi)鈣離子實時變化技術,結合分子生物學檢測探討孕期咖啡因暴露可能誘導子代血管平滑肌細胞中與膜電位調(diào)節(jié)相關的鈣信號及其與下游大電導鈣依賴性鉀通道(Large conductance Ca2+ dependent-K+-channels, BKCa)偶聯(lián)的異常,致膜電位失衡,血管張力增加。
第一部分孕期咖啡因暴露對胎鼠發(fā)育及成年子代體重的影響
目的:研究孕期咖啡因暴露對胎鼠發(fā)育及成年子代大鼠體重的
3、影響。
方法:實驗組孕鼠從妊娠第3.5天到第19.5天給予咖啡因皮下注射(20mg/kg, twice a day)。對照組給予生理鹽水注射。在孕第20.5天剖腹產(chǎn)取胎鼠,稱量胎鼠體重、體長和尾長。自然分娩后,在哺乳期內(nèi)實驗組與對照組給予正常飲食,幼鼠母乳喂養(yǎng)。斷奶后,子代大鼠給予正常飲食直至5月齡用于實驗。隨機抽取部分子代成年大鼠,測體重。
結果:
1)孕期咖啡因暴露組胎鼠的體長、尾長、體重明顯低于對照組
4、胎鼠;孕期咖啡因暴露導致胎鼠宮內(nèi)生長受限(IUGR)發(fā)生率顯著增加;
2)子代成年大鼠體重各組間無顯著差異。
結論:孕期咖啡因暴露導致胎鼠宮內(nèi)生長受限,經(jīng)過追趕性生長,子代成年大鼠(雄性)的體重差異消失。
第二部分孕期咖啡因暴露對子代血壓,腸系膜動脈收縮功能及血管平滑肌細胞膜電位的影響
目的:研究孕期母體咖啡因暴露對子代大鼠血壓、心率等心血管功能指標和離體腸系膜動脈張力的影響,并在細胞水平初步指出
5、子代血管張力的變化與平滑肌細胞膜電位調(diào)節(jié)異常相關。
方法:子代大鼠行股動、靜脈插管術,以PowerLab生理記錄儀在體動態(tài)監(jiān)測動物清醒無應激條件下的血壓、心率等指標。部分子代分離腸系膜動脈后,制備血管環(huán),以PowerLab生理記錄儀檢測血管張力情況。分離單個腸系膜動脈平滑肌細胞,以膜片鉗技術記錄細胞膜電位。
結果:
1)孕期咖啡因暴露誘導成年子代升壓反應異常,基礎狀態(tài)下兩組子代收縮壓、舒張壓、平均動脈壓和心
6、率等心血管指標無明顯差異;在血管收縮物質(zhì)如去氧腎上腺素(PE)刺激下,孕期咖啡因組子代的升壓反應較正常對照組子代明顯;
2)孕期咖啡因暴露誘導成年子代阻力血管張力增大,對PE的收縮反應較對照組明顯。在PE作用下咖啡因組子代腸系膜動脈的最大收縮及pD2都較對照組明顯增大。兩組內(nèi)皮功能未見明顯損傷;
3)孕期咖啡因組子代腸系膜動脈平滑肌細胞膜電位調(diào)節(jié)出現(xiàn)異常。雖然靜息狀態(tài)下,兩組膜電位未見明顯差異,但PE作用下,孕期咖啡
7、因組子代細胞膜電位去極化異常,膜電位較對照組明顯升高。
結論:血管收縮劑PE引發(fā)的異常升壓反應可能與阻力血管張力增大,平滑肌細胞收縮增強有關
第三部分孕期咖啡因暴露對子代平滑肌細胞膜電位調(diào)節(jié)相關的細胞鈣信號的影響
目標:研究孕期母體咖啡因暴露對子代平滑肌細胞膜電位調(diào)節(jié)相關鈣信號的影響。
方法:電壓門控性鈣通道電流以Ba2+作載體,并在電極內(nèi)液中加Cs+及細胞外液中加TEA-Cl阻斷鉀電流,采用傳統(tǒng)
8、全細胞電壓鉗模式來記錄全細胞鈣電流。以熒光鈣成像實時同步檢測血管細胞內(nèi)鈣與血管直徑變化,觀察ryanodine阻斷對胞內(nèi)鈣釋放和血管收縮反應的影響。用Western blot法對比兩組LTCCsα1C亞基的表達,用RT-PCR和 ELISA技術檢測兩組 RyRs亞型的表達,熒光顯微鏡下觀察 caffeine對ryanodine敏感的鈣庫的耗竭作用。
結果:L型鈣通道電流密度在孕期咖啡因組顯著下降;孕期咖啡因組子代腸系膜動脈L型
9、鈣通道α1C亞基的蛋白表達水平顯著低于對照組;孕期咖啡因暴露可誘導胞ryanodine敏感的內(nèi)鈣釋放功能降低。
結論:L型鈣通道功能下降致胞外鈣內(nèi)流效果減弱,但是孕期咖啡因暴露可誘導胞ryanodine敏感的內(nèi)鈣釋放功能降低,此作用可能進一步誘導了胞內(nèi)鈣釋放偶聯(lián)的下游BKCa通道的調(diào)節(jié)減弱,致使膜電位去極化增強
第四部分孕期咖啡因暴露對子代腸系膜動脈平滑肌細胞BKCa通道電流的影響
目的:研究孕期咖啡因暴露
10、對子代腸系膜動脈平滑肌細胞BKCa通道電流的影響
方法:運用膜片鉗單通道技術檢測子代腸系膜動脈平滑肌細胞BKCa通道生物物理特性的變化。運用穿孔膜片鉗技術檢測各組BKCa通道瞬時外向鉀電流的變化。運用傳統(tǒng)全細胞模式記錄BKCa通道全細胞電流。運用Western blot技術檢測兩組BKCa通道α亞基和β1亞基蛋白表達水平。
結果:
1)孕期咖啡因暴露誘導子代腸系膜動脈平滑肌全細胞鉀電流密度降低,BKCa通道
11、電流密度降低;
2)孕期咖啡因暴露誘導子代腸系膜動脈平滑肌細胞瞬時外向鉀電流(STOCs)活性下降;
3)孕期咖啡因刺激誘導BKCa通道生物物理特性異常:BKCa通道電壓敏感性,Ca2+敏感性下降;動力學特征改變,表現(xiàn)為開放時間縮短,關閉時間延長;
5)孕期咖啡因暴露對子代腸系膜動脈BKCa通道α亞基蛋白表達無明顯影響,β1亞基蛋白表達下調(diào)。
結論:孕期母體咖啡因暴露通過改變子代平滑肌細胞BKCa
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