NF-κB介導(dǎo)的Rab27A表達(dá)上調(diào)促進(jìn)結(jié)腸癌干細(xì)胞的干性.pdf

1、結(jié)腸癌全球高發(fā)，常規(guī)治療后往往發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，治愈率低，致死率世界排名第四。腫瘤干細(xì)胞（Cancer Stem Cells，CSCs）是腫瘤組織中具有自我更新、多向分化潛能、無(wú)限增殖能力、轉(zhuǎn)移和耐藥特征的數(shù)量極少的細(xì)胞群，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的決定性因素。因此深入研究腫瘤干細(xì)胞調(diào)控機(jī)制有助于設(shè)計(jì)針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的治療策略。
　　腫瘤干細(xì)胞處在一個(gè)由內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、炎性細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞等組成的微環(huán)境“niche”中。腫瘤干

2、細(xì)胞微環(huán)境介導(dǎo)的基因表達(dá)異常是腫瘤演變過(guò)程中重要分子事件。微環(huán)境中的炎性因子通過(guò)激活腫瘤干細(xì)胞相關(guān)通路，如Notch、Hedgehog、STAT3和NF-κB，實(shí)現(xiàn)對(duì)CSCs的調(diào)控；同時(shí)CSCs通過(guò)分泌細(xì)胞因子對(duì)自身所處的“niche”進(jìn)行改造。研究腫瘤干細(xì)胞如何應(yīng)對(duì)腫瘤微環(huán)境中的炎癥信號(hào)，以及如何通過(guò)自分泌和旁分泌的方式對(duì)微環(huán)境產(chǎn)生影響是本課題的研究方向。
　　在細(xì)胞分泌途徑中Rab蛋白家族發(fā)揮著重要作用。Rab為小GTP酶，屬

3、于Ras超家族，主要負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸，Rab27是其中主要負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)分泌的蛋白，有兩個(gè)異構(gòu)體 Rab27A和Rab27B。Rab27A功能失常會(huì)引發(fā)疾病的發(fā)生，如格里塞利綜合征和代謝綜合癥。在腫瘤研究領(lǐng)域，過(guò)表達(dá)Rab27A促進(jìn)乳腺癌和黑色素瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。Rab27A以外泌體依賴(lài)和非依賴(lài)的方式對(duì)腫瘤微環(huán)境進(jìn)行改造，為腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移提供條件。本研究旨在回答Rab27A是否影響結(jié)腸癌干細(xì)胞的功能？其機(jī)制是否與細(xì)胞因子分泌有關(guān)？炎癥

4、信號(hào)NF-κB是否影響 Rab27A的表達(dá)？
　　目的：
　　1)利用結(jié)腸癌臨床樣本，腫瘤細(xì)胞系和腫瘤干細(xì)胞微球培養(yǎng)模型，檢測(cè)Rab27A與腫瘤惡性程度以及腫瘤干細(xì)胞干性是否存在相關(guān)性。
　　2)干預(yù)Rab27A是否對(duì)HT29腫瘤干細(xì)胞干性和增殖有影響?
　　3)在上述功能變化的基礎(chǔ)上，回答Rab27A影響腫瘤干細(xì)胞的功能是否與細(xì)胞因子分泌有關(guān)。
　　4)最后探討腫瘤干細(xì)胞的炎癥微環(huán)境是否參與影響Rab27

5、A在腫瘤干細(xì)胞中的表達(dá)水平。
　　方法和結(jié)果：
　　1)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌臨床樣本中 Rab27A染色陽(yáng)性率為66.7％。6株結(jié)腸腫瘤細(xì)胞系均能在腫瘤干細(xì)胞微球（tumor sphere）培養(yǎng)體系中生長(zhǎng)，但是球體形狀不同；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，這6株細(xì)胞系中干性標(biāo)志分子 CD44+細(xì)胞比例與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)性；RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示，Rab27A的表達(dá)水平與結(jié)腸癌的惡性程度呈正相關(guān)

6、性。
　　2)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示HT29 sphere中干細(xì)胞標(biāo)志物CD44+和PKH26high細(xì)胞比例明顯高于貼壁腫瘤細(xì)胞；RT-PCR結(jié)果顯示，與貼壁HT29細(xì)胞比較，腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志分子在傳代的 sphere中表達(dá)升高，而分化標(biāo)志分子表達(dá)降低。該結(jié)果表明通過(guò)腫瘤干細(xì)胞微球培養(yǎng)體系獲得的HT29 sphere具有干性特征。
　　3) RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示，在HT29 sphere中Rab27A的

7、表達(dá)高于貼壁HT29細(xì)胞；過(guò)表達(dá)Rab27A使HT29 sphere形成數(shù)目和體積增加；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá) Rab27A使 HT29腫瘤細(xì)胞中 CD44+和PKH26high細(xì)胞比例升高。RT-PCR和Westernblot結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)Rab27A使周期相關(guān)蛋白cyclinD和CDK4表達(dá)升高，而 p27表達(dá)降低；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)Rab27A后HT29腫瘤細(xì)胞和sphere細(xì)胞中S期細(xì)胞比例升高。同時(shí)，干涉Rab27

8、A后得到與過(guò)表達(dá)反向的結(jié)果。
　　4)過(guò)表達(dá)Rab27A的sphere培養(yǎng)上清促進(jìn)了HT29 sphere的生長(zhǎng)。ELISA結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)Rab27A的sphere培養(yǎng)上清中VEGF和TGF-β的濃度升高。我們通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察到，Rab27A呈現(xiàn)細(xì)胞核周單側(cè)聚集分布，分布密度由細(xì)胞核向細(xì)胞膜依次遞減；Rab27A表達(dá)水平高的細(xì)胞群中PKH26high細(xì)胞比例增加。該結(jié)果說(shuō)明Rab27A通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌影響腫瘤干細(xì)胞

9、的功能。
　　5)體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)表明，100個(gè)HT29 sphere細(xì)胞即可在免疫缺陷小鼠體內(nèi)成瘤。過(guò)表達(dá)Rab27A后，HT29腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)加快。CD31免疫組化結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)Rab27A組中血管生成高于對(duì)照組，可能與Rab27A促進(jìn)VEGF分泌有關(guān)。
　　6) RT-PCR和Westernblot結(jié)果顯示，HT29 sphere中p65表達(dá)高于正常HT29細(xì)胞。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，HT29 sp

10、here細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路活性高于正常HT29細(xì)胞。此外，RT-PCR結(jié)果顯示NF-κB下游靶基因IL-6的表達(dá)在傳代的HT29 sphere中升高。
　　7) RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)p65后Rab27A表達(dá)升高，而NF-κB信號(hào)通路抑制劑PDTC和BAY-11-7082使Rab27A表達(dá)降低。雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果表明，p65使Rab27A啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性升高，而PDTC和BAY-11-7082使

11、p65介導(dǎo)的 Rab27A啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性降低。
　　8) HT29腫瘤干細(xì)胞經(jīng)TNFα處理后，球體生長(zhǎng)速度加快；流式結(jié)果顯示CD44+和PKH26high細(xì)胞比例升高；雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果顯示HT29 sphere中NF-κB信號(hào)通路活性升高，同時(shí)RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示p65和Rab27A的表達(dá)升高。
　　結(jié)論：
　　本課題首次確定了Rab27A促進(jìn)了結(jié)腸癌干細(xì)胞的干性和增殖，并促進(jìn)了結(jié)腸癌腫瘤細(xì)