大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基通過(guò)ERK1-2促進(jìn)肌腱細(xì)胞增殖.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcells,MSCs）是一類(lèi)非造血干細(xì)胞，不僅來(lái)源廣泛而且具有一定的可塑性以及可以誘導(dǎo)分化為不同類(lèi)型的細(xì)胞，如成骨細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞等。MSCs通過(guò)分化參與組織損傷修復(fù)的能力使其成為臨床上最具應(yīng)用前景的干細(xì)胞類(lèi)型之一。近年來(lái)隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)，MSCs不僅可以通過(guò)定向分化替代受損組織，而且還可以通過(guò)旁分泌作用參與損傷修復(fù)。
　　肌腱損傷是臨床常見(jiàn)的疾病之一。基于干細(xì)胞的肌腱損傷修復(fù)研究

2、表明，多種因素可以誘導(dǎo)干細(xì)胞向肌腱細(xì)胞定向分化，包括細(xì)胞因子、力學(xué)拉伸、共培養(yǎng)環(huán)境等。但是，雖然有報(bào)道表明MSCs旁分泌可促進(jìn)多種組織的損傷修復(fù)，但MSCs旁分泌作用是否參與肌腱損傷修復(fù)目前還未有報(bào)道。
　　本文的主要研究目的是探究大鼠骨髓MSCs條件培養(yǎng)基（conditionedmediumfromratbonemarrowderivedmesenchymalstemcells,rMSCs-CM）對(duì)大鼠肌腱細(xì)胞增殖的影響以及信號(hào)

3、分子ERK1/2（extracellularregulatedproteinkinases1/2,ERK1/2）在此過(guò)程中的作用及其對(duì)肌腱細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。具體的工作內(nèi)容和結(jié)果如下：
　?、俅笫蠊撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞、肌腱細(xì)胞分離與培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（ratbonemarrowderivedmesenchymalstemcells,rMSCs）的原代培養(yǎng)：全骨髓分離法體外分離提取SD大鼠rMSCs。倒置相差顯微鏡觀察到rMSCs

4、細(xì)胞形態(tài)均一，呈梭形或三角形，核質(zhì)明顯，集落呈旋渦狀等。流式細(xì)胞儀對(duì)rMSCs細(xì)胞表面抗原鑒定結(jié)果顯示，96.9％的細(xì)胞CD90陽(yáng)性，92.9%的細(xì)胞CD44陽(yáng)性，1.13%的細(xì)胞CD34陰性，檢測(cè)結(jié)果符合間充質(zhì)干細(xì)胞的基本特征。
　　肌腱細(xì)胞的原代培養(yǎng)：用組織塊培養(yǎng)法提取SD大鼠前腳趾肌腱，20天左右后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。肌腱細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形纖維狀形態(tài)、折光性強(qiáng)、細(xì)胞核明顯。②rMSCs-CM對(duì)肌腱細(xì)胞增殖的影響課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，rM

5、SCs-CM處理24h、48h和72h對(duì)肌腱細(xì)胞的增殖均具有促進(jìn)作用，但促增殖效果差異不大，故本課題主要針對(duì)rMSCs-CM處理24h對(duì)肌腱細(xì)胞增殖的影響進(jìn)行研究。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)24h后，rMSCs-CM處理組肌腱細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組，約為對(duì)照組的1.5倍，細(xì)胞周期檢測(cè)顯示，rMSCs-CM處理組細(xì)胞的增值指數(shù)PI顯著高于對(duì)照組，提示rMSCs-CM處理24h能顯著促進(jìn)肌腱細(xì)胞增殖。
　?、踨MSCs-CM通過(guò)激活

6、ERK1/2促進(jìn)肌腱細(xì)胞增殖研究發(fā)現(xiàn)，rMSCs-CM處理15、30、60、90和120min均能顯著刺激肌腱細(xì)胞p-ERK1/2的表達(dá)，其中15min激活最強(qiáng)烈，表達(dá)量約為對(duì)照組的1.8倍（p<0.01），提示rMSCs-CM可能通過(guò)激活ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)肌腱細(xì)胞增殖。ERK1/2的抑制劑PD98059（50μM）能顯著抑制rMSCs-CM促進(jìn)的肌腱細(xì)胞ERK1/2磷酸化。對(duì)肌腱細(xì)胞增殖情況的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PD98059能顯著抑制r