紅色紅曲菌mrr基因的克隆與功能初步研究.pdf

1、紅曲菌（Monascus spp．）是用來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲的微生物，它能夠產(chǎn)生紅曲色素、Monacolin K、γ-氨基丁酸（γ-amino butyric acid，GABA）、麥角固醇等生理活性物質(zhì)，具有較高的商業(yè)價(jià)值。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于紅曲菌的研究主要集中在菌種分類(lèi)、選育，發(fā)酵條件研究，桔霉素檢測(cè)等方面，關(guān)于其分子生物學(xué)的研究剛剛起步，其功能基因研究主要集中于色素、桔霉素和Monacolin K代謝調(diào)控途徑等方面。
　　 雙組分

2、系統(tǒng)是細(xì)菌、植物與真菌中均存在的一種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，其包含組氨酸蛋白激酶與應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白兩個(gè)組分。研究表明，雙組分系統(tǒng)在絲狀真菌中與氧化應(yīng)激應(yīng)答、滲透壓應(yīng)答及孢子形成有關(guān)。目前為止，在紅曲菌中關(guān)于雙組分系統(tǒng)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法建立了包含10000多株T-DNA突變子的紅色紅曲菌（M．ruber）M-7轉(zhuǎn)化庫(kù)。本實(shí)驗(yàn)從轉(zhuǎn)化庫(kù)中選出8株T-DNA插入突變子，并對(duì)其菌落形態(tài)和顯微形態(tài)進(jìn)行了觀察

3、。在此基礎(chǔ)上，采用TAIL-PCR分離得到4株突變子的T-DNA側(cè)翼序列，并利用SON-PCR．對(duì)其中1株突變子DNA序列進(jìn)行了延伸，總共獲得5個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)基因mrr的編碼蛋白與曲霉屬（Aspergillus spp．）壓力應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白高度同源，利用基因敲除的方法對(duì)其功能進(jìn)行了初步研究，主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 1紅色紅曲菌突變子T-DNA側(cè)翼序列的克隆
　　 通過(guò)對(duì)143株T-DNA插入突變子與出發(fā)菌株M-7菌

4、落形態(tài)進(jìn)行比較，篩選得到8株菌落形態(tài)發(fā)生變化的突變子并對(duì)其顯微形態(tài)進(jìn)行了觀察。采用TAIL-PCR法對(duì)上述8株突變子T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列進(jìn)行了擴(kuò)增，得到了3192＃、3440＃、2341＃、3725＃4株突變子T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列。其中，突變子3192＃擴(kuò)增序列726bp，與構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）壓力應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白編碼基因重疊101bp。利用SON-PCR對(duì)此序列進(jìn)行延伸后獲得全長(zhǎng)為13649b

5、p的DNA序列。此序列共包含5個(gè)基因，其編碼氨基酸序列分別與曲霉屬Cog6、Nil3蛋白、BolA蛋白、AhpC/TSA家族蛋白及壓力應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白的同源性達(dá)到80％以上。
　　 2 mrr基因敲除
　　 壓力應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白編碼基因全長(zhǎng)2356bp，包含6個(gè)外顯子，5個(gè)內(nèi)含子，預(yù)測(cè)蛋白含634個(gè)氨基酸，具有一個(gè)保守的接受結(jié)構(gòu)域和一個(gè)DNA結(jié)合區(qū)，這兩者是應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白的基本原件。推測(cè)該基因可能是紅色紅曲菌雙組分系統(tǒng)中應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋

6、白編碼基因，將其命名為mrr（Monascus ruber response regulator）。構(gòu)建mrr基因敲除載體pCMRR，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法成功獲得3株△mrr突變子。
　　 3 mrr功能初步研究
　　 對(duì)△mrr突變子的性狀進(jìn)行了初步的研究，發(fā)現(xiàn)mrr基因的缺失使得紅曲菌的生長(zhǎng)速度加快，有性發(fā)育滯后。Mrr基因的缺失對(duì)于紅曲菌耐滲特性影響不顯著，但其缺失使得紅曲菌對(duì)外界氧化壓力的敏感性增大，△mr