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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:建立一種特異、敏感、快速的檢測(cè)海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌的雙重PCR和胞內(nèi)分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、龜分枝桿菌的三重PCR方法,為臨床快速鑒定手部非結(jié)核分枝桿菌感染的早診斷、早治療提供檢測(cè)方法。
方法:在GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)中分別查找出海分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、龜分枝桿菌4種手部常見(jiàn)NTM的特異基因序列,根據(jù)上述四種細(xì)菌的特異基因序列用 NCBI/Primer-BLAST軟件系統(tǒng)設(shè)計(jì)各自引物序列,并用M
2、FEPrimer-2.0軟件篩選出特異的、相互間無(wú)互補(bǔ)或互補(bǔ)配對(duì)較少的引物分別構(gòu)建海、潰瘍分枝桿菌的雙重PCR和胞內(nèi)分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、龜分枝桿菌3種NTM的三重PCR。將從菌種庫(kù)購(gòu)買(mǎi)的海分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、龜分枝桿菌4種標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行增殖培養(yǎng),培養(yǎng)后將菌落移至無(wú)菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)1~2天進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)菌DNA的提取。用海、潰瘍、胞內(nèi)、龜分枝桿菌的DNA與相應(yīng)細(xì)菌的引物進(jìn)行單重 PCR擴(kuò)增驗(yàn)證引物的特異性,再用海分枝桿菌的
3、引物、潰瘍分枝桿菌的引物分別和海、潰瘍分枝桿菌的DNA擴(kuò)增驗(yàn)證雙重PCR的特異性,同理,用胞內(nèi)分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、龜分枝桿菌的特異性引物和胞內(nèi)分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、龜分枝桿菌的DNA擴(kuò)增驗(yàn)證三重PCR的特異性。同時(shí),根據(jù)雙重PCR、三重PCR各自的引物的退火溫度,摸索最佳退火溫度,優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。將構(gòu)建的兩個(gè)多重PCR用于14例考慮手部NTM感染標(biāo)本的檢測(cè)。
結(jié)果:
1.用成功構(gòu)建的兩個(gè)多重PCR檢測(cè)14例臨床手
4、部考慮NTM感染標(biāo)本,檢出率為93%;
2.海、潰瘍分枝桿菌的雙重PCR、胞內(nèi)分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、龜分枝桿菌的三重 PCR最佳退火溫度分別是57.5℃、58.6℃;
3.兩個(gè)多重 PCR檢測(cè)臨床手部NTM感染標(biāo)本的時(shí)間大約是6小時(shí),較傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室鑒定NTM時(shí)間短。
結(jié)論:本研究構(gòu)建的兩個(gè)多重PCR可鑒定引起手部感染的海分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、龜分枝桿菌的常見(jiàn)NTM,可早期、快速、可靠的檢測(cè)出
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