人腦膠質(zhì)瘤中miR-451通過CAB39基因調(diào)控P13K-AKT通路的實驗研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤，呈浸潤性生長，具有高致命性和侵襲性，平均生存期為9-12個月。盡管對癌癥的基礎(chǔ)生物學(xué)研究和對其他腫瘤的治療有了很大進展，但對于膠質(zhì)瘤的診斷及治療在過去的四十年中沒有明顯進展[1，2]。這其中最主要的原因是我們對膠質(zhì)瘤的確切發(fā)病機制尚不清楚。現(xiàn)有的綜合治療方法主要包括外科手術(shù)切除、術(shù)后放化療以及免疫治療等，治療效果差，復(fù)發(fā)率高，臨床預(yù)后較差。因此，尋找、研究與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因、信號通路及

2、分子病理機制，開拓膠質(zhì)瘤的治療新策略和新手段便成為神經(jīng)外科的重要課題之一。
　　近些年的研究表明，在人腦膠質(zhì)瘤中某些microRNA呈現(xiàn)異常表達，這其中包括miR-451[3]。通過對miRNA的研究為探索腫瘤的發(fā)生機制和治療方法提供了全新思路[4]。miRNA是一類微小(～22nt)非編碼RNA，其作用主要是通過與靶基因的3’端非轉(zhuǎn)錄區(qū)域(3’UTR)特異性結(jié)合，致使靶基因降解或抑制其的翻譯，從而對基因進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[5-11]

3、。這些miRNA在細胞凋亡、增殖、分化、生長和代謝中發(fā)揮重要作用[12-14]。特別是相對于正常組織，腫瘤組織中miRNA表達量的異常改變更顯得尤為重要15。
　　miR-451位于染色體17q11.2，與原癌基因ERBB2(17q12)區(qū)域相鄰[16，17]。研究表明miR-451可以抑制細胞生長[3]、增殖、侵襲并增強細胞凋亡能力[18]。異常表達miRNA的相關(guān)靶基因的確定有助于更加準確的闡明miRNA在癌癥生物學(xué)中的作用[

4、15]。我實驗室的前期研究顯示，miR-451很可能通過調(diào)控AKT的表達，從而影響腦膠質(zhì)瘤細胞的增值、侵襲以及凋亡。故本課題通過對比miR-451在正常腦組織及膠質(zhì)瘤不同級別中表達量情況、尋找其靶點并探索可能存在的作用機制，以期為膠質(zhì)瘤的綜合治療提供全新方法及思路。
　　本課題研究分為以下四個部分：
　　第一部分中應(yīng)用實時定量PCR(RT-PCR)的方法，我們檢測了5例正常腦組織、41例不同級別人腦膠質(zhì)瘤組織和4個膠質(zhì)瘤細胞

5、系中miR-451的表達水平。結(jié)果表明miR-451的表達在膠質(zhì)瘤中較正常組織顯著下降，并與腫瘤級別呈負相關(guān)。此外，我們又應(yīng)用原位雜交技術(shù)檢測5例正常腦組織及75例膠質(zhì)瘤制備的組織芯片中miR-451的表達，得到了與RT-PCR一致的檢測結(jié)果。
　　第二部分為miR-451對P13K/AKT通路調(diào)控的研究。此部分實驗采用TargetScan5.1、STRING[19]蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)、KEGG[20]代謝網(wǎng)絡(luò)、miRNA靶向基因

6、預(yù)測軟件[21]、RNAhybrid[22]程序來尋找miR-451靶基因；應(yīng)用寡核苷酸has-miR-451mimics轉(zhuǎn)染4個膠質(zhì)瘤細胞系，并通過RT-PCR檢測miR-451的表達效果；應(yīng)用Westernblot檢測轉(zhuǎn)染has-miR-451mimics后目標基因的表達變化；應(yīng)用熒光素酶報告試驗驗證miR-451靶基因；應(yīng)用免疫組化檢測靶基因與膠質(zhì)瘤級別間的相關(guān)性變化；最后應(yīng)用Westernblot檢測P13K/AKT通路上相關(guān)基

7、因的表達變化。結(jié)果顯示，應(yīng)用STRING蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示AKT1與AKTIP和YWHAZ存在直接相關(guān)性，與CAB39存在間接相關(guān)性，這三個基因均為miR-451的靶基因，KEGG代謝網(wǎng)絡(luò)分析顯示存在CAB39-AMPK-mTOR-AKT1通路。因此STRING蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)及KEGG代謝網(wǎng)絡(luò)共同指向CAB39可能為hsa-miR-451靶基因。轉(zhuǎn)染has-miR-451mimics后腫瘤細胞miR-451表達明顯升高，CA

8、B39表達量降低。熒光素酶實驗顯示較control組、scramble組及pGL3-CAB39-3’UTR-Mut組，共轉(zhuǎn)染has-miR-451mimics和pGL3-CAB39-3’UTR-wild質(zhì)粒時熒光強度顯著增高。故可推斷CAB39是miR-451靶基因。我們之前的通過RT-PCR和原位雜交研究顯示miR-451的表達與膠質(zhì)瘤WHO級別呈負相關(guān)，在此我們應(yīng)用免疫組化發(fā)現(xiàn)了一個相似結(jié)果，CAB39基因的表達量與膠質(zhì)瘤WHO級別

9、呈現(xiàn)正相關(guān)。實驗室的前期研究顯示，miR-451很可能通過調(diào)控AKT的表達，從而影響腦膠質(zhì)瘤細胞的增值、侵襲以及凋亡，因此，我們研究了AKT相關(guān)通路，轉(zhuǎn)染miR-451mimics后U251，LN229，A172andU87細胞系中，miR-451過表達使得AKT相關(guān)通路上的LKB1，AMPK，P-AMPK，及P13K表達量明顯下降。這些數(shù)據(jù)表明miR-451很可能通過P13K/AKT通路在膠質(zhì)瘤細胞中發(fā)揮抑癌作用。
　　第三部分

10、構(gòu)建LN229裸鼠皮下荷瘤模型，以進一步研究miR-451的抑瘤作用及其對P13K/AKT的信號通路的調(diào)控。當腫瘤生長至直徑約5mm時，將裸鼠隨機分為三組(每組6只)：control組、scramble組和miR-451mimics組，并在腫瘤局部多點注射治療，治療每3天一次直至實驗結(jié)束。每3天測量一次腫瘤體積。21天觀察期結(jié)束后，處死小鼠，取出腫瘤組織，福爾馬林固定，石蠟包埋，免疫組化檢測腫瘤標本的相關(guān)蛋白表達情況。結(jié)果表明，miR-

11、451mimics組對裸鼠移植瘤的抑瘤作用較對照組及scramble組明顯增強(均P<0.01)；miR-451mimics組中P13K/AKT通路中的LKB1，AMPK，p-AMPK，P13K，p-AKT。蛋白表達量較control組和scramble組顯著降低。
　　結(jié)論：miR-451在膠質(zhì)瘤細胞系和膠質(zhì)瘤標本中低表達，并與腫瘤病理分級呈負相關(guān)。通過生物信息學(xué)分析，蛋白免疫印跡檢測和熒光素酶實驗，我們證實CAB39基因為mi