sfat-1真核表達(dá)載體構(gòu)建及其轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系建立.pdf

1、n-3多不飽和脂肪酸作為細(xì)胞構(gòu)成的重要成分，一直以來受到人們的廣泛關(guān)注。研究表明，哺乳動物體內(nèi)一定量的n-3多不飽和脂肪酸含量，可以起到預(yù)防心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病甚至癌癥的作用。但n-3多不飽和脂肪酸在大多數(shù)動物體內(nèi)不能合成，只能從食物中補(bǔ)充。fat-1基因的發(fā)現(xiàn)改變了這一現(xiàn)狀，它可以將多不飽和脂肪酸從n-6形式轉(zhuǎn)化為n-3形式，并發(fā)揮功能。研究人員已經(jīng)利用轉(zhuǎn)基因的方法制備了能夠表達(dá)fat-1基因的轉(zhuǎn)基因動物，如：小鼠、豬等，為研究

2、n-3多不飽和脂肪酸的功能提供了高效、準(zhǔn)確的醫(yī)學(xué)、營養(yǎng)學(xué)動物模型。 隨著人們對n-3多不飽和脂肪酸認(rèn)識的增加，對富含這一成分的食品需求也大大增加，fat-1基因在生產(chǎn)特殊農(nóng)產(chǎn)品方面也具有十分大的潛力，亟待我們開發(fā)利用。本實(shí)驗(yàn)采剛經(jīng)密碼子優(yōu)化了的線蟲基因sfat-1，使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法獲得轉(zhuǎn)sfat-1基因荷斯坦奶牛細(xì)胞，并將其應(yīng)用到克隆研究中。實(shí)驗(yàn)中通過PCR-酶切連接方法人工合成了sfat-1基因，并構(gòu)建了基于真核表達(dá)載體p

3、CDNA3.1(+)的轉(zhuǎn)基因載體pCDNA3.1(+)-sfat-1-EGFP及陰性對照載體pCDNA3.1(+)-EGFP；利用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，對自建8079TE細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作，經(jīng)過G418篩選獲得剛性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，經(jīng)PCR、RT-PCR檢測證明外源基因已整合進(jìn)入細(xì)胞基因組內(nèi)。 作為階段性成果，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的pcDNA3.1(+)-EGFP對照載體，為實(shí)驗(yàn)室后來轉(zhuǎn)基因研究提供了良好的對照；建立的8079TE細(xì)胞系可以為多