蛋氨酸-膽堿缺乏飲食誘導非酒精性單純性脂肪肝小鼠模型建立與益生菌治療的動態(tài)觀察.pdf

1、[研究目的]:非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)在我國是高患病率的慢性肝臟疾病，發(fā)病率逐年上升。NAFLD的確切發(fā)病機制尚不清楚，目前認為是一種與胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝臟損傷。NAFLD疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝(nonalcoholic simple fatty liver，NAFL)、非酒精性脂肪性

2、肝炎(Non-alcoholicsteatohepatitis，NASH)以及肝硬化，并最終可進展為肝細胞癌。因此，盡早的對NAFLD進行干預是改善患者預后的重要手段，而目前尚無有充足循證醫(yī)學證據(jù)的藥物治療手段。并且，因其作為金標準的病理學診斷存在創(chuàng)傷，該疾病的目前診斷主要依賴臨床診斷，診斷的準確性和敏感性仍有待提高，尤其非酒精性單純性脂肪肝因其發(fā)病隱匿、癥狀不典型，因而發(fā)現(xiàn)較為困難。因此，建立合適的動物模型模型對于研究非酒精性單純性脂

3、肪肝疾病的規(guī)律、改善診斷和治療手段的意義重大。
　　 [研究方法]:研究分為兩個部分。第一部分:1、根據(jù)隨機分組的原則，24只小鼠隨機分入觀察組(n=12)和正常對照組(n=12);2、觀察組小鼠給予蛋氨酸-膽堿缺乏飲食(MCDD)飼養(yǎng)3周，對照組給予正常飲食;3、動態(tài)觀察小鼠的一般情況，定期稱取體重、留取新鮮糞便標本進行四種細菌屬的培養(yǎng)（包括大腸桿菌、糞腸球菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌）;4、分別于第8、15、22d處死小鼠，處死后

4、采集血清標本和肝臟標本;5、鹿清標本用于檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、甘油三酯(TG)，并采用酶聯(lián)免疫法檢測腫瘤壞死因子a(TNF-a)、白介素-6(IL-6)以及脂多糖(LPS)水平。第二部分:1、對32只上述2周模型小鼠再次進行隨機分組，分為藥物治療組(D組，n=16)和飲食恢復組(B組，n=16)，并按1∶2設(shè)立正常對照同周齡小鼠8只（C組，n=8）;2、對藥物治療組小鼠每日兩次經(jīng)胃管給予培菲康治

5、療，時間共計6周;3、動態(tài)觀察小鼠的一般情況，定期稱重、進行糞便細菌培養(yǎng);4、于第43天處死小鼠，處死后采集血清標本和肝臟標本;5、所得肝臟標本進行病理學診斷并進行評分量化;6、對所采集血清標本進行ALT、AST、TG、TNF-a、IL-6、LPS檢測;7、上述結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，組內(nèi)比較采用配對t檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性檢驗，干預治療效果比較采用單因素方差分析，均以P＜0.05為具有統(tǒng)計學意

6、義。
　　 [結(jié)果]:
　　 第一部分:
　　 1、經(jīng)MCD飲食誘導，小鼠出現(xiàn)精神萎靡、毛發(fā)紊亂等現(xiàn)象，病理分析明確從第8d起小鼠肝臟內(nèi)即出現(xiàn)肝脂肪性變，而8d、15d時間節(jié)點小鼠的肝臟病理NAS評分均在3-4分間，與22d（＞5分）、正常對照組（0分）有差異，提示MCD誘導2周即可出現(xiàn)穩(wěn)定NAFL小鼠模型，并且病變階段控制在NAFL階段。
　　 2、MCDD模型小鼠與對照組小鼠相比體重從第4天起下降明顯

7、(P=0.02)，并出現(xiàn)毛發(fā)紊亂、精神萎靡等一般情況的改變;糞便細菌培養(yǎng)提示了隨著MCDD造模時間的延長，模型組小鼠相對正常對照組小鼠逐漸出現(xiàn)了腸道菌群的紊亂。
　　 3、血清中ALT、AST水平隨造模時間的延長，均數(shù)呈上升趨勢，但各時間節(jié)點與對照組相比均無顯著統(tǒng)計學差異;TG的水平也隨時間變化呈現(xiàn)增長趨勢，且各時間節(jié)點均與正常對照組呈顯著統(tǒng)計學差異。
　　 4、血清TNF-a、IL-6、LPS水平造模組小鼠和對照組小鼠

8、在各時間節(jié)點均表現(xiàn)出了差異。造模組小鼠血清TNF-a、LPS水平各時間節(jié)點均有顯著差異，且與造模時間呈明顯正相關(guān)關(guān)系。
　　 5、在P＜0.05的水平，TNF-a、IL-6、LPS、ALT均與病理學評分呈正相關(guān)關(guān)系，其中TNF-a、IL-6、LPS相關(guān)關(guān)系極強(r=0.843，0.839，0.884)，ALT與病理評分關(guān)系中等(r=0.574);腸道細菌培養(yǎng)的B/E值與病理學評分呈負相關(guān)，關(guān)系比較強(r=-0.662)。

9、　　 第二部分:
　　 1、干預治療組（D組）小鼠一般情況恢復明顯優(yōu)于恢復飲食組（B組），B組死亡率達31.25％，其中三只死亡原因考慮為感染、兩只死亡原因不明。體重兩組均在3周內(nèi)恢復至正常，D組稍快，但兩組比較無顯著統(tǒng)計學差異。
　　 2、D組腸道菌群紊亂恢復明顯，第11天B/E值即與正常組無顯著差異(P=P=0.02)，且保持相對穩(wěn)定。僅通過飲食恢復，B組腸道菌群紊亂不能得到糾正。
　　 3、B組小鼠肝臟脂

10、肪性病變?nèi)匀幻黠@，且小葉內(nèi)炎癥明顯加重;D組小鼠脂肪性病變程度隨時間延長有所下降，小葉內(nèi)炎癥幾乎未見加重。干預治療使D組病理表現(xiàn)有所改觀，與B組有顯著統(tǒng)計學差異(P=0.032)。
　　 4、相關(guān)性分析顯示代表腸道定植力的B/E值與病理評分在P=0.05水平上呈中等強度的負相關(guān)關(guān)系(r=-0.526)，而乳酸桿菌與糞腸球菌均與病理評分在P=0.01水平上呈較強強度的負相關(guān)關(guān)系（r=-0.648，-0.632）。提示了腸道菌群的異

11、常和NAFLD的病變程度之間的相關(guān)性。
　　 5、干預治療后D組小鼠TNF-a、IL-6、LPS水平均與干預治療前相比有所下降，而B組IL-6水平較前有所下降，TNF-a、LPS水平與干預前相比反而升高，干預對兩組TNF-a、IL-6、LPS水平的影響均表現(xiàn)出了顯著的統(tǒng)計學差異(P=0.012，0.004，0、026)。而干預后D組小鼠表達水平與同周齡的正常對照組小鼠比較仍有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　 6、干預治

12、療后B組小鼠ALT、AST、TG水平均與干預治療前相比略有升高，而D組小鼠均與干預前相比下降明顯，干預效果兩組表現(xiàn)出了顯著的統(tǒng)計學差異(P=0.056,0.013,0、007)。
　　 [結(jié)論]:MCD飲食誘導2周可形成穩(wěn)定的NAFL動物模型，該動物模型出現(xiàn)顯著的血脂及炎性因子、內(nèi)毒素水平升高，升高程度與病變程度關(guān)系明顯，肝酶關(guān)系不明顯。NAFLD動物模型存在明確腸道菌群紊亂，補充培菲康干預治療可有效糾正，僅恢復飲食治療不能改善