脂多糖和維生素D對雞腸上皮細胞β-防御素表達的影響.pdf

1、抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是先天免疫反應(yīng)的效應(yīng)分子，其在保護機體免受病原菌威脅的過程中作用顯著。AMPs具有廣譜的抗細菌、真菌、病毒以及支原體活性，其表達分為固定表達和誘導(dǎo)表達且受免疫應(yīng)激類因子和營養(yǎng)因子類調(diào)控，如脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）和維生素D。家禽主要包含兩大類AMPs分子，即β-防御素和cathelicidins，其中β-防御素14種、cathelicidins

2、4種。在人、小鼠以及牛等哺乳動物的研究中發(fā)現(xiàn)維生素D對AMPs有調(diào)控作用，提示可通過營養(yǎng)因素提高機體β-防御素的表達從而提高機體對外界病原的抵抗力進而達到減少抗生素在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用的目的。家禽中是否存在這種調(diào)節(jié)機制尚未見報道。腸道在擔(dān)負消化和吸收功能的同時還具有免疫功能，是研究維生素D在免疫應(yīng)激條件下對其β-防御素基因表達的影響的理想模型。
　　本研究中我們優(yōu)化了雞腸上皮原代細胞分離、培養(yǎng)的條件。結(jié)果表明:15日齡的雞胚的腸道組

3、織更適用于腸上皮細胞的分離、培養(yǎng);采用多次少時的消化策略得到的健全的腸隱窩集團更多、活力更強，對雞胚的利用率大大提高;采用細胞篩區(qū)分隱窩和單個細胞從而對腸上皮細胞進行純化所耗時間大為減少、純度更高，純度可達到85％以上;腸上皮原代細胞培養(yǎng)24 h-48 h進入對數(shù)增長期，72 h后細胞界限模糊，開始出現(xiàn)凋亡。
　　設(shè)置不同濃度的LPS(0、50、100、200、400、800μg/mL)和維生素D(00.2、2、20、200 ng

4、/mL)處理對數(shù)生長期的腸上皮原代細胞。結(jié)果表明:低濃度的LPS不能引起腸上皮細胞的免疫反應(yīng)，800μg/mL的LPS能顯著提高TLR4、IL-1和IL-6的表達，即選取800μg/mL的LPS處理作為激活雞腸上皮細胞免疫反應(yīng)的有效濃度;單獨添加維生素D對腸上皮細胞表達VDR、IL-1和IL-6的表達無顯著作用，但在添加LPS的基礎(chǔ)上，其能顯著提高VDR的表達、顯著降低IL-1和IL-6的表達，表明維生素D能抑制由LPS引起的炎性反應(yīng)，

5、且這種抑制作用隨維生素D的濃度升高而加強。綜合考慮，選取20μg/mL為維生素D的處理濃度。
　　以篩選的LPS濃度和VD濃度處理雞腸上皮原代細胞。結(jié)果表明，LPS能顯著提高GAL-1、GAL-3、GAL-4、GAL-5、GAL-6、GAL-9、GAL-10、GAL-12和GAL-13的表達;維生素D能顯著提高GAL-3、GAL-4、GAL-5、GAL-6和GAL-9的表達，但這種作用僅在免疫應(yīng)激條件下才有所體現(xiàn);對14種雞β-防