澤瀉醇B誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡、抑制其侵襲、轉(zhuǎn)移的機制研究.pdf

1、胃癌是我國常見的惡性腫瘤，占消化道惡性腫瘤第一位，是目前對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，已成為絕大多數(shù)國家因癌癥死亡的首要原因。目前對胃癌的治療還是傳統(tǒng)的手術(shù)、化療和放療。盡管傳統(tǒng)治療方法取得了顯著進展，但胃癌的病死率仍然居高不下，同時化療和放療也往往給患者帶來較大的毒副作用。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對中醫(yī)藥防治胃癌開展了大量的研究工作，其在防治胃癌發(fā)病及提高患者生存率方面的獨特療效，受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。誘導(dǎo)細胞凋亡已成為中醫(yī)藥

2、防治胃癌的重要機理之一。
　　 澤瀉醇B-23-乙酸酯是三萜類純中藥提取物，為澤瀉科植物澤瀉[Alismaorientalis(Sam)Juzep]的主要成分，具有利尿、降血脂、抗脂肪肝及保肝、抗炎、抗過敏等作用。近年的研究表明其可通過激活caspase-3誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡；使腫瘤細胞阻滯在G2/M期誘導(dǎo)淋巴瘤細胞凋亡；逆轉(zhuǎn)P-gp導(dǎo)致HepG2-DR和K562-DR細胞的耐藥性，誘導(dǎo)HepG2-DR和K562-DR細胞凋亡。進

3、一步研究顯示其可通過線粒體內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)耐激素性前列腺癌PC-3細胞的凋亡，同時前列腺癌細胞促凋亡因子bax蛋白表達增加，并發(fā)生細胞質(zhì)向細胞核的轉(zhuǎn)移。對肺癌的研究提示澤瀉醇B具有較強的抗惡性腫瘤轉(zhuǎn)移作用。本實驗研究了澤瀉醇B對SGC7901細胞增殖、細胞周期及調(diào)亡的影響，檢測細胞凋亡過程中線粒體膜電位及caspase3、caspase9、Bax、Bcl-2及PI3 K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化；研究澤瀉醇B對胃癌細胞侵襲及遷移的影響，及

4、在抑制胃癌細胞侵襲、遷移過程中，MMP-2、MMP-9活性、蛋白及PI3 K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化，闡明澤瀉醇B誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡，抑制其侵襲及轉(zhuǎn)移的機制，為其進一步臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 一、實驗材料
　　 1、人胃腺癌細胞系SGC7901
　　 2、澤瀉純B
　　 3、流式細胞儀檢測相關(guān)染料
　　 4、Western印跡雜交相關(guān)試劑
　　 5、細胞侵襲實驗

5、相關(guān)材料
　　 二、實驗方法
　　 1、MTT檢測澤瀉純B對胃癌SGC7901細胞體外增殖的抑制作用
　　 2、PI染色流式細胞儀(FCM)分析細胞周期
　　 3、Annexin V-FITC染色檢測細胞早期調(diào)亡
　　 4、倒置顯微鏡、透射電鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)變化
　　 5、瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片斷化
　　 6、羅丹明-123染色、流式細胞儀檢測線粒體膜電位的變化
　　

6、7、Transwell小室分析澤瀉純B對胃癌SGC7901侵襲、遷移的影響
　　 8、酶譜分析法檢測MMP-2、MMP-9活性的變化
　　 9、Western-blot半定量法檢測Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bcl-2、PI3 K/Akt、MMP-2、MMP-9表達情況
　　 結(jié)果：
　　 1、MTT法檢測結(jié)果顯示30μmol/L以上濃度澤瀉純B對胃癌SGC7901細胞體外增殖的具有明

7、顯的抑制作用，該抑制作用呈明顯的時間和劑量依賴性(P<0.05或P<0.01)。
　　 2、顯微鏡下細胞稀疏、變圓、皺縮，一些細胞膜向外鼓出小泡，然后脫落形成凋亡小體；透射電鏡，細胞核內(nèi)異染色質(zhì)凝聚；細胞核膜溶解，核內(nèi)異染色質(zhì)凝聚破碎成多塊于胞質(zhì)中，并見有膜包裹，形成凋亡小體。
　　 3、瓊脂糖凝膠電泳見明顯的梯形條帶，具有時間依賴性(DNA laddrer)。
　　 4、AnnexinV-FITC/PI熒光染色

8、，流式細胞分析AnnexinV/FITC(+)，PI(-)細胞即早期凋亡細胞增加(P<0.05)。
　　 5、PI染色染色流式細胞儀檢測細胞周期，S期細胞的比例逐漸降低，G1期細胞的比例逐漸升高，并存在時間依賴性。同時在流式細胞儀DNA組方圖上出現(xiàn)典型的凋亡細胞峰(亞G1峰)。
　　 6、羅丹明-123染色流式細胞儀檢測線粒體膜電位，澤瀉純處理12小時后SGC7901線粒體膜電位開始下降，隨著作用時間的延長下降比例逐漸增

9、加具有時間依賴性。
　　 7、Western-blot半定量法檢測Bax表達增高，持續(xù)維持在高水平；Bcl-2表達降低，持續(xù)維持在低水平
　　 8、Western-blot半定量法檢測caspase-3和caspase-9，caspase-3出現(xiàn)17ku的斷裂片段，47 kucaspase-9出現(xiàn)37 ku的斷裂片斷，且二者的活性片斷隨著澤瀉純作用時間的延長持續(xù)維持在高水平；
　　 9、Western-blot半

10、定量法檢測磷酸化的PI3 K、Akt(Thr308)表達量降低，而總的PI3 K、Akt的量沒有變化。
　　 10、細胞侵襲遷移能力的檢測。
　　 應(yīng)用Transwell小室檢測澤瀉純B對胃癌SGC7901細胞侵襲、遷移能力的影響，發(fā)現(xiàn)澤瀉純B處理后實驗組細胞的侵襲、遷移能力有明顯降低，遷移及侵襲過Transwell小室膜的細胞隨藥物濃度的增加逐漸減少，并具有劑量依賴性
　　 11、酶譜分析法檢測澤瀉純B處理前后

11、SGC7901細胞MMP-2、MMP-9酶活性，Western-blot半定量法檢測MMP-2，MMP-9蛋白表達量情況，隨著藥物作用時間的延長MMP-2、MMP-9酶活性逐漸降低，MMP-2，MMP-9蛋白表達量逐漸下降，并具有時間依賴性
　　 結(jié)論：
　　 1、澤瀉純B對胃癌SGC7901細胞體外增殖具有明顯的抑制作用，該抑制作用呈明顯的時間和劑量依賴性
　　 2、顯微鏡下、透射電鏡DNA片斷化分析及Anne

12、xinV-FITC/PI熒光染色流式細胞分析證實了澤瀉純B誘導(dǎo)SGC7901細胞的凋亡。
　　 3、澤瀉純B誘導(dǎo)SGC7901細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中多種基因、蛋白酶以及多種激酶參與了凋亡的調(diào)控。Bcl-2、Bax表達的改變，線粒體膜電位的下降，進而caspase-9、caspase-3的激活，PI3 K/Akt激酶的激活參與細胞凋亡的調(diào)控。
　　 4、澤瀉純B導(dǎo)致SGC7901細胞周期的改變，使SGC7901細胞阻抑在