放射性核素顯像監(jiān)測肺癌多藥耐藥狀態(tài)的動物實驗研究.pdf

1、背景:肺癌是發(fā)達國家的主要腫瘤，在我國，特別是大中城市的發(fā)病率逐年上升。上海市最新統(tǒng)計，肺癌發(fā)病率占惡性腫瘤發(fā)病率的第1位。雖然外科手術結合放、化療的綜合治療使肺癌的療效有所提高，但遠期療效仍不佳。這除了肺癌出現癥狀較晚，發(fā)現較晚以外，肺癌對化療的耐藥性也是重要原因之一。腫瘤的耐藥現象，主要有原發(fā)性耐藥和臨床上較為常見的多次化療后所出現的獲得性耐藥。 肺癌耐藥性的產生有多種機理，P糖蛋白(P-glycprotin，P-gp)和多

2、藥耐藥相關蛋白(multidrugresistance-associatedprotein，MRP)相關的多藥耐藥是肺癌耐藥的機理之一。P糖蛋白具有“藥物泵”的功能，對各種藥物進入細胞和從細胞內清除起重要作用。它與各種植物類和抗生素類抗癌藥物耐藥性的產生密切相關，而對此類耐藥性的檢測仍是臨床上一個難以解決的問題。 目前，檢測P-gp的方法有免疫組化法、PCR(多聚酶鏈反應)、Westemblot法、放免自顯像法、流式細胞術等。這

3、些技術均須對組織活檢，在體外進行定性定量分析，具有創(chuàng)傷性，并且受試驗精確度、腫瘤樣本差異以及各種技術的敏感性和特異性的限制；同時由于對化療后標本的取材不方便，這就在一定程度上影響了對化療前后腫瘤多藥耐藥狀態(tài)的動態(tài)觀察及耐藥調節(jié)劑有效性的觀察。因此，尋找一種無創(chuàng)、靈敏、可以對腫瘤化療前后進行動態(tài)觀察的方法是很有必要的。近來，大量研究發(fā)現，MIBI(甲氧基異丁基異腈)不僅用于心肌顯像和腫瘤顯像，還被認為是P-gp底物，可以為P-gp識別、泵

4、出，從而可用99mTc-MIBI肺腫瘤陽性顯像功能性識別P-gp，反映腫瘤的耐藥狀態(tài)。MIBI是一種親脂性陽離子復合物，主要用于心肌彌漫成像。由于其親脂性和正電性，該示蹤劑通過被動擴散進入活性細胞，并濃聚于線粒體內膜，而代謝產物琥珀酸鹽增加其與線粒體結合。在體外實驗中，其攝取和存留與由跨膜電位推動的被動彌散有關，凈細胞攝取量與P-gp的表達成正比，給予調節(jié)劑后攝取量明顯增加。從而可以用99mTc-MIBI功能成像的方法無創(chuàng)性地觀察P-g

5、p的表達狀態(tài)，評估腫瘤多藥耐藥的狀態(tài)，以及檢測多藥耐藥逆轉劑的逆轉能力。 該課題通過動物實驗對99mTc-MIBI腫瘤顯像與腫瘤細胞P-gp表達相關性進行了研究，并同時探討了99mTc-MIBI腫瘤顯像監(jiān)測維拉帕米逆轉肺腺癌多藥耐藥狀態(tài)的可行性，為利用功能顯像無創(chuàng)性監(jiān)測腫瘤多藥耐藥狀態(tài)探索新的方法。 目的:利用BALB/c裸鼠SPCA-1人肺腺癌移植瘤模型，通過99mTc-MIBI顯像及感興趣區(qū)(regionofinte

6、rest，ROI)半定量分析，觀察應用維拉帕米逆轉前后，腫瘤多藥耐藥狀態(tài)變化情況，并與流式細胞儀檢測結果進行對比，以探討應用顯像進行腫瘤多藥耐藥狀態(tài)監(jiān)測的可行性。 材料與方法: 1.細胞培養(yǎng)：人肺腺癌細胞株SPCA-1細胞在含10μmolL阿霉素和質量分數10％胎牛血清的培養(yǎng)液中呈單層貼壁生長。培養(yǎng)箱為37℃、體積分數5％CO2。當SPCA-1細胞進入對數生長期后，采用不含阿霉素而含質量分數10％胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)

7、7d，常規(guī)消化細胞，吹打，調整細胞濃度至106個/ml。 2.動物模型制備：隨機選取20只4周齡的雌性BALB/c裸鼠，常規(guī)消毒裸鼠右前肢背部的皮膚，每只裸鼠皮下注射0.2ml～0.3ml細胞懸液，當腫塊直徑長至1.5cm左右時進行顯像。 3.顯像研究：MIBI藥盒由北京師范大學師宏藥物中心提供，99mTcO4-淋洗液由中國原子能科學研究院同位素研究所提供，按說明書標記，標記率大于96％。將20只裸鼠隨機分為維拉帕米逆轉

8、組和對照組，每組10只。兩組均行首次顯像。顯像前腹腔注射8％戊巴比妥鈉0.15ml/20g，使荷瘤裸鼠昏睡，經尾靜脈注射99mTc-MIBI7.4MBq，注射后15min，60min，120min分別用SPECT(東芝GCA-901A/HG)采集荷瘤裸鼠后位平面圖像。采集條件：針孔準直器，矩陣256×256，放大倍數為3.0，每幀計數＞300K。對照組僅行一次顯像，顯像后立即處死，取腫瘤組織行流式細胞儀檢測。逆轉組在第1次顯像后，第2天

9、按0.1mg/g體重對所有裸鼠均腹腔注射維拉帕米，該劑量分3天注射，在第5天同上方法再次進行99mTc-MIBI顯像，顯像后立即處死裸鼠，取腫瘤組織行流式細胞儀檢測P-gp表達狀況。利用感興趣區(qū)技術，在每只裸鼠的靜態(tài)平面圖像上計算腫瘤與對側正常部位的放射性計數比(T/N)，比較不同時間的T/N，同時計算120min相對于15min的核素滯留率，并與流式細胞儀結果進行對比。 結果: 1.顯像特征，逆轉組第一次顯像和對照組顯

10、像15min顯像各有1例裸鼠未能顯示腫瘤，其余均能顯示腫瘤，但圖像較模糊，在60min時，逆轉組有2只裸鼠，對照組有3只裸鼠不能顯示腫瘤，在120min時，逆轉組有5只裸鼠，對照組有7只裸鼠不能顯示腫瘤。逆轉組在第二次顯像時，均能顯示腫瘤，且圖像明顯好于第一次顯像。 2.腫瘤攝取比值(TUR)，對照組與逆轉組第二次顯像間、逆轉組第一次顯像與第二次顯像間15min、60min以及120min的TUR均有顯著性差異(p＜0.01)。

11、對照組和逆轉組第一次顯像間各時間點TUR均無顯著性差異(p＞0.05)。各組顯像的15minTUR，60minTUR及120minTUR之間無顯著性差異(p＞0.05)。計算對照組、逆轉組第一次顯像和第二次顯像120min相對于15min的滯留率(RI)。對照組RI與逆轉組第一次顯像RI、對照組RI與逆轉組第二次顯像RI、逆轉組第一次顯像RI與逆轉組第二次顯像RI之間均無顯著性差異(p＞0.05)。 3.逆轉前后流式細胞儀檢測，

12、對照組P-gp蛋白表達陽性細胞的百分率為(65.5±25.0)％，逆轉組P-gp蛋白表達陽性細胞的百分率為(40.2±17.7)％，二者有顯著性差異(p＜0.05)。各時相的TUR與流式細胞儀檢測的P-gp蛋白表達陽性細胞的百分率呈負相關(p＜0.05)。RI與流式細胞儀檢測的P-gp蛋白表達陽性細胞的百分率無相關關系(p＞0.05)。 結論:99mTc-MIBI顯像與SPCA-1人肺腺癌腫瘤細胞P-gp的表達成負相關，可以較好