長春新堿載體紅細胞磁化技術(shù)的實驗研究.pdf

1、目的： 探討應用納米級Fe<,3>O<,4>磁流體(Fe<,3>O<,4> nano-magnetic ferrofluid，MF)與長春新堿(Vincristine，VCR)建立及優(yōu)化磁化紅細胞及磁化VCR載體紅細胞的制備方法并研究其體外抗腫瘤細胞作用，探索MF、VCR對系統(tǒng)血液免疫功能的影響。 方法 用健康成人血及昆明種小鼠血以改良低滲預膨脹.等滲重封閉法制備磁化紅細胞及磁化VCR載體紅細胞，優(yōu)化載體制備條件

2、及觀察方法。檢測載體紅細胞生理指標、載體細胞回收率、滲透脆性、貯存穩(wěn)定性，探討磁流體和VCR雙載紅細胞體外抗腫瘤的生物學特性。比較靶細胞K562細胞增殖、周期和凋亡的變化，驗證雙載紅細胞抗腫瘤活性。利用體外自然實驗體系原理，采用免疫熒光標記流式細胞儀分析方法，檢測磁流體和長春新堿對血細胞表面相關(guān)免疫分子表達的變化規(guī)律。 結(jié)果 磁化紅細胞及磁化VCR載體紅細胞載藥參數(shù)良好。磁化VCR載體紅細胞生物學特性與VCR載體紅細胞無

3、差別，對K562細胞都有明顯抑制增殖和促進凋亡作用，與未載和磁化紅細胞有顯著差異。磁流體和VCR共用可明顯提高CD<,4>細胞陽性率(38.87±6.37)％(P<0.01)，而磁流體單用時白細胞CD<,55>陽性細胞平均熒光強度(68.79±8.98)％明顯降低(P<0.05)。 結(jié)論 磁化VCR載體紅細胞載藥參數(shù)良好，殺傷腫瘤細胞效果明顯。抗腫瘤藥物載體紅細胞靶向治療腫瘤具有一定可行性和廣闊應用前景，但有關(guān)磁流體品種

4、的優(yōu)選還需進一步深入研究。VCR和磁流體對血細胞的免疫功能都沒有不良影響，而且磁流體還可以提高血液免疫反應中自細胞的免疫功能。 一、磁化長春新堿載體紅細胞制備的優(yōu)化實驗研究 目的和意義 紅細胞作為抗癌藥物長春新堿(Vincristine，VCR)載體可減少用藥量和提高療效，但其靶向性差。設想用紅細胞雙載VCR和納米級Fe<,3>O<,4>磁流體(Fe<,3>O<,4> nano-magnetic ferroflu

5、id，MF)，借助于外加磁場以解決VCR紅細胞載體的靶向問題。探討磁流體磁化紅細胞及相關(guān)載體制備最佳實驗條件及分離與鑒定方法，觀察和分析磁化紅細胞(即單載MF紅細胞，MF載體紅細胞)載藥參數(shù)及磁化VCR載體紅細胞(即雙載VCR及MF紅細胞，MF+VCR載體紅細胞)體外相關(guān)生物學特性，為紅細胞靶向治療腫瘤提供實驗方法。 方法 磁化紅細胞制備的優(yōu)化實驗研究1、選擇最佳實驗條件：通過對分散劑的研究解決磁流體凝聚問題；建立改良低

6、滲預膨脹一等滲重封閉法制備MF載體紅細胞；研究MF濃度與磁響應性關(guān)系、RBC與MF的比例、不同低滲液濃度對結(jié)果的影響、去除血小板與否、超聲與否的比較優(yōu)化載體制備條件。 2、選擇最佳分離條件：比較永磁鐵、脫脂棉、脫脂棉外加磁場、濾紙等幾種分離方法的優(yōu)劣，選擇將未載入紅細胞的磁流體從反應體系中移除的最適方法。 3、選擇合適的鑒定方法：比較涂片技巧、磁化紅細胞終產(chǎn)物隨外磁場移動情況、染色、電鏡觀察等方法，選擇鑒定紅細胞是否已被

7、磁化的適合檢測方法。 4、選擇合適的磁流體：比較三種分散性及磁響應性不同的磁流體特性，選擇符合磁化紅細胞條件的磁流體。 5、以自動細胞分析儀測定全血、洗滌、預膨脹和載體紅細胞的數(shù)量、平均容積(MCV)、平均血紅蛋白含量(MCHC)等指標，考察載體紅細胞回收率等載藥參數(shù)及生理特性的變化情況。比較磁化紅細胞的貯存穩(wěn)定性。采用滲透脆性檢測法比較載藥處理各階段對紅細胞滲透脆性的影響。 6、比較昆明種小鼠血與人血磁化方法的

8、區(qū)別以及磁化后載體紅細胞載藥參數(shù)及生理特性的差別。 結(jié)果 (一)磁化紅細胞制備的優(yōu)化實驗研究 1、用血漿作分散劑解決磁流體凝聚問題；改良低滲預膨脹-等滲重封閉法制備磁化紅細胞；提前超聲分散磁流體顆粒、MF濃度為0.5mg/ml、去除血小板影響、選擇肉眼可見溶血之后第二個濃度低滲液作為膨脹液、RBC與MF比例為2∶1時是最佳實驗條件。 2、通過濾紙過濾分離未包載入紅細胞的磁流體。 3、通過質(zhì)控方法的

9、改進、觀察實驗終產(chǎn)物隨外磁場移動情況、直接涂片、普魯士蘭染色、透射電鏡等方法證明紅細胞已被磁化。 4、選擇含超順磁性氧化鐵(SPIO)表面是氨基硅烷的磁流體(Fe<,3>O<,4>納米顆粒直徑8～12nm)作為磁化劑。 5、磁化紅細胞回收率為(67.50±4.55)％，MCV減小(4.00±1.06)％，血紅蛋白含量減少(18.12±3.27)％。單載紅細胞滲透脆性降低，但無統(tǒng)計學意義。磁化紅細胞穩(wěn)定貯存可達5天。

10、 6、昆明種小鼠血磁化實驗條件與人血制備條件基本一致，磁化后載體紅細胞載藥參數(shù)及生理特性與人血無顯著差異。 (二)磁化VCR載體紅細胞制備的優(yōu)化實驗研究： 1、以改良低滲預膨脹.等滲重封閉法先后包載VCR、MF為制備磁化VCR載體紅細胞的最佳方法。 2、當紅細胞、VCR、MF三者比例1∶1∶1、提前超聲分散磁流體顆粒、MF濃度為0.5mg/ml、去除血小板影響、選擇肉眼可見溶血之后第二個濃度低滲液作為膨脹液時

11、包載效果最好。通過濾紙過濾分離未包載入紅細胞的磁流體。通過觀察實驗終產(chǎn)物隨外磁場移動情況、直接涂片、普魯士蘭染色、透射電鏡等方法證明紅細胞已被磁化。 3、雙載紅細胞MCV減小(5.204±1.31)％，血紅蛋白含量減少(19.04±3.55)％，載體紅細胞回收率(69.16±3.15)％，滲透脆性降低，但無統(tǒng)計學意義。磁化VCR載體紅細胞在PBS中穩(wěn)定貯存可達5天。雙載紅細胞MCV、滲透脆性變化、穩(wěn)定貯存時間與磁化紅細胞無明顯差

12、異。 結(jié)論 1、以改良低滲預膨脹-等滲重封閉法和適合的磁流體品種制備磁化紅細胞可行，載藥參數(shù)良好，載體紅細胞生理特性無明顯改變，為進一步探討紅細胞靶向治療腫瘤提供理論和實驗依據(jù)。 2、以改良低滲預膨脹-等滲重封閉法先后包載VCR、MF制備MF+VCR載體紅細胞可行，實驗條件與單載MF紅細胞制備條件基本一致，紅細胞、VCR、MF三者比例1∶1∶1時是最佳濃度配比。雙載紅細胞與磁化紅細胞回收率及生理特性無明顯改變，紅

13、細胞能夠作為抗癌藥靶向治療腫瘤的載體。 二、磁化VCR載體紅細胞對腫瘤細胞作用的體外實驗研究 目的和意義 比較磁化VCR載體紅細胞、VCR單載紅細胞與單獨使用VCR對腫瘤細胞的作用以及在外加磁場條件下磁化VCR載體紅細胞對抗腫瘤的作用，探討磁化VCR載體紅細胞體外抗腫瘤效果，為紅細胞作為靶向藥物載體的抗腫瘤治療提供理論和實驗依據(jù)。 方法 采用改良低滲預膨脹.等滲重封閉法制備載體紅細胞。比較MF+V

14、CR載體紅細胞、MF載體紅細胞、VCR載體紅細胞、未載藥紅細胞、MF+VCR工作液、VCR工作液、MF工作液、空白對照、MF+VCR載體紅細胞加弱磁場組(0.3T)、MF+VCR載體紅細胞加強磁場組(1.8T)、MF載體紅細胞加弱磁場組(0.3T)、MF載體紅細胞加強磁場組(1.8T)、MF+VCR工作液加磁場組(0.9T)、VCR工作液加磁場組(0.9T)、MF工作液加磁場組(0.9T)、空白對照加磁場組(0.9T)等十六組的抗癌效果

15、。采用載體紅細胞與K562細胞共培養(yǎng)的方式，MTF法檢測K562細胞的增殖情況，PI染色流式細胞儀分析K562細胞周期，Annexin V-FITC/PI染色流式細胞儀分析K562細胞凋亡情況。 結(jié)論 磁化VCR載體紅細胞對K562細胞具有明顯增殖抑制和促進凋亡作用，在外加磁場條件下抗腫瘤作用增強。K562細胞周期分析結(jié)果符合VCR的抗腫瘤作用機制。體外抗腫瘤實驗證明，與未載紅細胞和磁化紅細胞相比，雙載紅細胞殺傷腫瘤細胞

16、作用更強。 三、磁流體與長春新堿對系統(tǒng)血液免疫功能影響的實驗研究 目的和意義 探討磁流體對機體生理功能的影響，特別是對免疫功能是否有負面影響。利用現(xiàn)代系統(tǒng)免疫學理論與方法研究磁流體和VCR聯(lián)合應用對系統(tǒng)血液免疫功能是否有正負影響，為VCR載體紅細胞磁化研究提供實驗和理論依據(jù)。 方法 在體外利用自然實驗體系原理，采用免疫熒光標記流式細胞儀分析方法，研究納米級Fe<,3>O<,4>磁流體(MF)和抗癌

17、藥物長春新堿(VCR)對系統(tǒng)血液免疫功能的影響進行分子水平的探討，檢測兩者對血細胞表面相關(guān)免疫分子(CD<,4>、CD<,8>、CD<,55>、CD<,59>等)表達影響的變化規(guī)律。 結(jié)論 VCR(0.2mg/ml)和納米級Fe<,3>O<,4>磁流體對血細胞的免疫功能都沒有不良影響，甚至磁流體還可以調(diào)控和改善血液免疫反應中白細胞的免疫功能，為紅細胞包載磁流體和抗癌藥物治療腫瘤提供理論和實驗依據(jù)，為抗癌藥紅細胞載體靶向抗