含HIV-1gp120基因抗原決定簇的重組缺陷脊髓灰質(zhì)炎病毒的構建及其表達的初步研究.pdf

1、背景：HIV引起的艾滋病(AIDS)自被發(fā)現(xiàn)以來，一直嚴重威脅著人類的健康，目前無有效的預防措施，抗HIV藥價格昂貴，易引起不良反應，療效也不盡人意。近年來，活病毒載體疫苗的研究受到了越來越多的重視，HIV-1的gp120基因一直是艾滋病疫苗研究的重點。缺陷性脊髓灰質(zhì)炎病毒可誘導系統(tǒng)性的體液免疫、細胞免疫和腸道粘膜免疫，缺失P1區(qū)蛋白編碼序列的脊髓灰質(zhì)炎病毒突變體能自我復制，且其質(zhì)量、安全檢測手段已經(jīng)完善建立。因而應用缺陷性脊髓灰質(zhì)炎病

2、毒表達載體構建含HIV-1gp120基因重組疫苗有很大的應用前景，目前國內(nèi)還未見用脊髓灰質(zhì)炎病毒表達載體構建HIV重組疫苗的正式報道。 目的：為有效的控制艾滋病的流行，為進一步研究預防性或治療性的HIV疫苗提供實驗基礎。本研究以pT7gp120基因為模板，缺陷性脊髓灰質(zhì)炎病毒為載體，構建含HIV-1gp120基因抗原決定簇的重組缺陷脊髓灰質(zhì)炎病毒，并研究其表達、形態(tài)及遺傳穩(wěn)定性。 方法：1、構建重組HIV-19p120基

3、因脊髓灰質(zhì)炎病毒表達載體：選擇了中國HIV-1B亞型代表毒株，以質(zhì)粒pT7gp120為模板，缺陷性脊髓灰質(zhì)炎病毒為載體，構建含HIV-1gp120基因抗原決定簇的重組缺陷脊髓灰質(zhì)炎病毒，并通過PCR、酶切鑒定證實HIV-1gp120基因片段是否正確的插入到脊髓灰質(zhì)炎病毒載體。2、HIV-1gp120基因的表達的檢測：1)用脂質(zhì)體轉染技術將重組質(zhì)粒轉染Hela細胞，用G418試劑對轉染后的細胞進行壓力篩選，得到轉入重組脊髓灰質(zhì)炎病毒表達載

4、體的細胞株Hela-gp120，通過RT-PCR檢測混合細胞系中HIV-1gp120基因的表達，鑒定是否有目的基因的插入；2)通過免疫酶法檢測混合細胞系中HIV-1gp120基因的表達，檢測到是否有目的基因的表達；3)將重組病毒感染293細胞，經(jīng)過Western blot方法檢測重組缺陷脊髓灰質(zhì)炎病毒是否能感染細胞并表達目的基因片段的蛋白產(chǎn)物。3、重組HIV-1gp120基因脊髓灰質(zhì)炎病毒形態(tài)觀察：通過重組痘苗病毒提供缺陷脊髓灰質(zhì)炎病毒

5、的衣殼蛋白，組裝重組脊髓灰質(zhì)炎病毒完整顆粒，并通過氯仿-PEG/NaCl-氯仿三步法純化重組脊髓灰質(zhì)炎病毒，電鏡下觀察重組病毒形態(tài)。4、重組HIV-1gp120基因脊髓灰質(zhì)炎病毒安全性及遺傳穩(wěn)定性觀察：將重組脊髓灰質(zhì)炎病毒感染的293細胞繼續(xù)培養(yǎng)傳代檢測疫苗的安全性及遺傳穩(wěn)定性。 結論： 1、成功構建了含HIV-1gp120基因片段重組脊髓灰質(zhì)炎病毒，且能在體外表達HIV-1gp120基因片段；2、構建的含HIV-1gp120基