電刺激小腦頂核對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠海馬星形膠質細胞的影響.pdf

1、新生兒缺氧缺血性腦損傷(Hypoxic-Ischemic Brain Damage,HIBD)是指由于圍生期的窒息缺氧所導致的腦損傷,輕癥者預后良好,中重癥者常遺留視聽障礙、智力障礙、腦癱、癲癇等神經系統(tǒng)后遺癥,是導致兒童神經系統(tǒng)損傷的主要原因,但目前尚無有效的治療方法,給整個社會及家庭帶來沉重的負擔。因此,尋找治療新生兒HIBD及降低其后遺癥發(fā)生率的有效方法成為醫(yī)學工作者關注的焦點。
　　 神經膠質細胞(neuroglial

2、cell)是神經組織中除神經元以外的另一大類細胞,星形膠質細胞(astrocytes,AS)作為神經膠質細胞的一種類型,在數(shù)量上占有絕對的優(yōu)勢,約為神經元的10～50倍,星形膠質細胞一度被認為是大腦的填充物,對神經元僅起營養(yǎng)、支持、保護和絕緣的作用,在神經系統(tǒng)中擔任著次要的、被動的角色。近年來人們對星形膠質細胞的形態(tài)結構及功能進行了較為廣泛的研究,發(fā)現(xiàn)它在神經系統(tǒng)發(fā)育、神經組織修復與再生、神經免疫及突觸傳遞等方面都起著十分重要的作用,使

3、我們對其有了重新的認識。
　　 目的：電刺激小腦頂核(fastigial nucleus electrical stimulation,FNS)作為一種促進神經功能恢復的物理療法拓展了腦損傷治療的新途經,而且采用仿生物電技術,模擬實驗性FNS而研制的小腦電刺激儀,已廣泛應用于成人腦缺血疾病的治療并取得了較滿意的療效。目前關于FNS對新生兒HIBD的研究多集中于神經元上,對神經膠質細胞的研究尚少,基于星形膠質細胞在神經系統(tǒng)中的重要

4、作用,本實驗在建立HIBD新生大鼠模型的基礎上,電刺激小腦頂核,通過觀察大鼠腦組織海馬區(qū)星形膠質細胞超微結構的變化、檢測膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillaryacidic protein,GFAP)表達的變化來探討電刺激小腦頂核對新生兒HIBD的腦保護作用。
　　 材料與方法：
　　 1.實驗動物分組及HIBD模型的制備新生7日齡健康清潔級SD大鼠180只,雌雄不限,體重13-16g,隨機分為假手術組、模型組

5、和電刺激組,每組各60只,各組于制模術后又按3天、7天、14天、21天隨機分為4組,每組各15只。采用改良的的RICE法:以新生7日齡SD大鼠為研究對象,乙醚吸入麻醉后,分離并結扎左側頸總動脈后,遂置于缺氧箱中,持續(xù)充以氣流量為2L·min-1的92:8氮氧混合氣體2小時,大鼠出現(xiàn)左旋夾尾者則證明模型制備成功,可納入實驗。
　　 2.電刺激干預
　　 電刺激組大鼠于術后第2天開始給予電刺激治療,電刺激大鼠耳后部小腦頂核(

6、相當于人體的雙側乳突部),30分鐘／次,1次／天,電刺激強度為3.5V、頻率50HZ,使大鼠肢體稍有震顫為宜。假手術組及模型組大鼠不予電刺激治療,相應時間點僅予抓捕固定。
　　 3.標本采集與制備各組分別于術后3天、7天、14天、21天隨機取5只大鼠經乙醚吸入麻醉后,剪開胸腔暴露心臟,剪開右心耳建立循環(huán)通道,先以生理鹽水快速灌注沖洗至右心耳流出澄清液體,隨即換用40g／L多聚甲醛-5g／L戊二醛混合液內固定,沿頸部斷頭后迅速取左

7、海馬切成1mm×1mm×1mm大小,遂將其置于40g／L戊二醛溶液中固定保存,應用透射電鏡觀察大鼠海馬區(qū)星形膠質細胞的超微結構。其余大鼠于同樣的時間點經乙醚吸入麻醉后,心臟灌注40g／L多聚甲醛固定腦組織,斷頭取腦,做冠狀切片,應用HE染色觀察大鼠腦組織病理形態(tài)學改變,免疫組化檢測大鼠海馬區(qū)膠質纖維酸性蛋白(GFAP)的表達。
　　 4.腦組織海馬區(qū)星形膠質細胞的超微結構將電鏡樣本經PBS液沖洗后,放入1％鋨酸中后固定,經脫水、

8、包埋、聚合、50nm超薄切片、醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重電子染色后,應用日立H-7500型透射電子顯微鏡觀察星形膠質細胞超微結構的變化。
　　 5.腦組織海馬區(qū)HE染色及膠質纖維酸性蛋白(GFAP)的表達光鏡下觀察大鼠腦組織海馬區(qū)病理形態(tài)學變化。
　　 膠質纖維酸性蛋白(GFAP)陽性表達呈棕黃色,用彩色病理圖像分析系統(tǒng)測量切片海馬區(qū)GFAP積分光密度值,每張切片取5個視野測量,取其平均積分光密度值。
　　 6.統(tǒng)計學

9、分析
　　 應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析,數(shù)據(jù)均以(x)±s表示,多組均數(shù)比較用單因素方差分析,組間兩兩比較用最小顯著差異(LSD)檢驗,以α=0.05作為顯著性檢驗水準。
　　 結果：
　　 1.大鼠腦組織海馬區(qū)星形膠質細胞的超微結構模型組大鼠腦組織海馬區(qū)星形膠質細胞胞質水腫,線粒體大部分嵴和膜融合,游離核糖體減少,核異染色質增加,邊集于核膜下,粗面內質網不同程度脫顆粒；電刺激組大鼠海馬區(qū)星形膠質細胞腫脹減

10、輕,胞質中細胞器豐富,包括線粒體、粗面內質網及溶酶體,核膜清晰。
　　 2.大鼠腦組織海馬區(qū)HE染色假手術組大鼠海馬區(qū)神經細胞排列整齊,形態(tài)正常,胞質豐富,胞漿染色均勻,細胞核清楚,核仁明顯；模型組大鼠海馬區(qū)錐體細胞排列紊亂,可見明顯的壞死灶,神經細胞數(shù)量明顯減少,部分神經細胞胞體縮小為三角形,核濃縮深染,核仁消失。電刺激組大鼠海馬區(qū)神經細胞排列有序,變性壞死較少,多數(shù)細胞形態(tài)相對正常,細胞核清楚。
　　 3.膠質纖維酸

11、性蛋白(GFAP)免疫組織化學方法染色模型組及電刺激組大鼠3天時GFAP的平均積分光密度值與假手術組比較即有升高且有統(tǒng)計學意義(p<0.05),7天、14天、21天時GFAP的平均積分光密度值仍較假手術組高,且在7天時達到高峰,電刺激組GFAP的平均積分光密度值在各時間點均較模型組同時間點低且有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。
　　 結論：
　　 (1)電刺激小腦頂核可減輕星形膠質細胞的結構性損傷。
　　 (2)電刺