無選擇標記轉(zhuǎn)中國對蝦抗菌肽基因水稻的獲得及其遺傳分析和抗病檢測.pdf

1、抗菌肽Antimicrobial peptides, AMPs具有廣譜殺菌作用和不易引起病原微生物產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，可以顯著提高動植物的抗病能力。本研究利用雙 T-DNA載體系統(tǒng)將中國對蝦抗菌肽基因DP3和選擇標記基因HPT導(dǎo)入到水稻恢復(fù)系明恢86中，以期獲得不含篩選標記，抗病性顯著增強的轉(zhuǎn)抗菌肽基因水稻。
　　前期工作中我們通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化共獲得了110個T0代轉(zhuǎn)基因植株。本研究分析了外源基因DP3和潮霉素抗性基

2、因HPT在T1代轉(zhuǎn)基因植株中的分離情況，獲得了只含目的基因不含篩選標記的轉(zhuǎn)基因植株；檢測了部分轉(zhuǎn)DP3基因植株對白葉枯病和紋枯病的抗病能力。最終獲得無選擇標記的抗病轉(zhuǎn)DP3基因水稻。主要研究結(jié)果如下：
　　1.植物雙T-DNA表達載體dph3轉(zhuǎn)化水稻明恢86，獲得110株T0代轉(zhuǎn)DP3基因植株。對所有 T1代轉(zhuǎn)基因株系進行潮霉素抗性檢測，結(jié)果顯示，有97個株系出現(xiàn)抗性和敏感分離，占總株系的88.2％，其中78個株系符合3:1或15

3、:1的分離比，19個株系不符合孟德爾分離定律。另外，還有13個株系所有植株均對潮霉素敏感，占總株系的11.8%。
　　2.對10個潮霉素抗感符合分離定律的轉(zhuǎn)基因株系進行單株 PCR檢測，統(tǒng)計分析選擇標記基因HPT和目的基因DP3在T1代的遺傳規(guī)律。結(jié)果顯示，兩個基因在3個株系中自由組合，4個株系出現(xiàn)連鎖。另外2個株系中的DP3基因不符合孟德爾的遺傳分離定律，1個株系沒檢測到目的基因DP3。在468個檢測單株中篩選出31個無選擇標記

4、的轉(zhuǎn)基因植株，約占總樣本的6.6%。
　　3. T1代轉(zhuǎn)基因植株RT-PCR檢測表明，抗菌肽基因DP3在mRNA水平上得到表達。DP3在株系E46中的表達量高于其他株系。
　　4.抗病檢測表明，用白葉枯病小種PXO86、PXO99和紋枯病小種GD-118、C-30對轉(zhuǎn)基因株系進行接種。與陰性對照相比，無選擇標記轉(zhuǎn)基因陽性植株對水稻白葉枯病和紋枯病的抗性明顯增強。無標記轉(zhuǎn)基因陽性植株的白葉枯病的病斑比值較為穩(wěn)定，一般在20%以