多西紫杉醇對(duì)肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549及其多藥耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549-CDDP的作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：(1)誘導(dǎo)建立人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/CDDP；(2)觀察多西紫杉醇對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549及其多藥耐藥細(xì)胞A549/CDDP的生長(zhǎng)抑制作用、細(xì)胞周期影響和誘導(dǎo)凋亡作用；(3)初步探討bcl-2、bax、Fas、p53、c-myc等凋亡相關(guān)蛋白在多西紫杉醇抗腫瘤作用機(jī)制中的作用。 方法：(1)以人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549為誘導(dǎo)對(duì)象，順鉑為誘導(dǎo)藥物，采用恒定藥物濃度、周期性作用的方法，建立在1μg/ml順鉑作用下生長(zhǎng)良好的耐

2、藥系A(chǔ)549/CDDP。應(yīng)用MTT法檢測(cè)耐藥細(xì)胞及其親代細(xì)胞對(duì)不同化療藥物的敏感性，倒置顯微鏡及透射電鏡觀察其細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其細(xì)胞周期。(2)應(yīng)用光鏡、透射電鏡、集落形成試驗(yàn)和MTT法等，檢測(cè)耐藥細(xì)胞及其親代細(xì)胞在多西紫杉醇作用后形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、集落形成能力和生長(zhǎng)抑制率的變化；應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化；應(yīng)用透射電鏡、TUNEL、AnnexinV/PI雙染法觀察多西紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。(3)應(yīng)用SP細(xì)胞免疫化學(xué)方法，

3、檢測(cè)bcl-2、bax、Fas、p53、c-myc等凋亡相關(guān)蛋白在多西紫杉醇作用A549及A549/CDDP細(xì)胞前后的表達(dá)情況。 結(jié)果：(1)成功誘導(dǎo)建立了人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/CDDP。MTT藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果表明，A549/CDDP細(xì)胞對(duì)順鉑、羥基喜樹堿、長(zhǎng)春新堿和5-氟尿嘧啶等4種化療藥物有不同程度的耐受性，其耐藥指數(shù)分別為12.00、2.29、8.6、16.84。細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，相對(duì)親代細(xì)胞，耐藥細(xì)胞體積

4、偏大，分化較好，核仁大而多，核漿比例大，線粒體短小且具有老化、退變現(xiàn)象，同時(shí)胞質(zhì)內(nèi)可見較多空泡和板層小體。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞倍增時(shí)間測(cè)定結(jié)果表明，耐藥細(xì)胞與其親代細(xì)胞增殖速度接近，細(xì)胞周期結(jié)果顯示耐藥細(xì)胞較親代細(xì)胞S期明顯增多(P＜0.05)。(2)多西紫杉醇對(duì)A549及A549/CDDP細(xì)胞均具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，并在0.1～2μg/ml劑量范圍內(nèi)存在劑量及時(shí)間依賴關(guān)系。A549/CDDP細(xì)胞在多西紫杉醇作用12～24h較親代細(xì)胞敏

5、感(P＜0.01)，在48h較親代細(xì)胞耐受(P＜0.01)，在72h則與親代細(xì)胞間無顯著性差異(P＞0.05)。(3)多西紫杉醇對(duì)A549及A549/CDDP細(xì)胞均具有顯著的G2/M期阻滯作用，親代細(xì)胞還表現(xiàn)出時(shí)間依賴性，而耐藥細(xì)胞于48h后出現(xiàn)四倍體細(xì)胞，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)大量多微核化細(xì)胞。加大藥物劑量后兩種細(xì)胞G2/M期細(xì)胞均顯著減少，同時(shí)出現(xiàn)S期細(xì)胞明顯增多即S期阻滯。(4)多西紫杉醇能誘導(dǎo)A549和A549/CDDP細(xì)胞凋亡、壞

6、死和胞質(zhì)自切，并以后兩者為主。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)空泡明顯增多，微絨毛減少甚至消失，線粒體出現(xiàn)腫脹甚至空泡化，同時(shí)，還存在少數(shù)凋亡小體和脫落的不含細(xì)胞器成分的細(xì)胞質(zhì)。(5)A549及A549/CDDP細(xì)胞均表達(dá)Fas、c-myc和p53蛋白，但A549/CDDP細(xì)胞還弱表達(dá)和表達(dá)bax和bcl-2蛋白。多西紫杉醇作用后，兩種細(xì)胞Fas表達(dá)均明顯增強(qiáng)，耐藥細(xì)胞bax表達(dá)也有所增強(qiáng)，而其余蛋白表達(dá)無明顯變化。 結(jié)論：(1)所