塞來昔布對非小細胞肺癌的抑制作用和放療、化療增敏作用的研究.pdf

1、非小細胞肺癌(NSCLC)占肺癌發(fā)病的80％，其惡性度高，對放療、化療不敏感，5年生存率低。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)氧合酶-2(COX-2)與腫瘤關(guān)系密切，在包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中表達增高。體內(nèi)外實驗證實COX-2抑制劑可有效抑制腫瘤生長，并增加放療和化療的細胞毒性，但不增加放化療對正常組織的毒性。塞來昔布是一種新型的選擇性COX-2的抑制劑，于1998年被美國FDA批準(zhǔn)用于預(yù)防家族性腸息肉的惡變。本研究探討了塞來昔布對NSCLC的抑制作用及

2、其放化療增敏作用，旨在為塞來昔布的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，為NSCLC的治療提供新的思路。本實驗分為如下三個部分： 第一部分：塞來昔布對非小細胞肺癌細胞的增殖抑制作用和侵襲抑制作用的研究 目的：研究選擇性環(huán)氧合酶-2抑制劑塞來昔布對非小細胞肺癌增殖抑制作用和侵襲抑制作用。 方法：1.四唑氮藍比色試驗(MTT)檢測塞來昔布對肺腺癌細胞株A549和肺鱗癌細胞株NCI-H520的體外增殖抑制作用。2.建立A549裸鼠移植

3、瘤模型，予以塞來昔布干預(yù)，檢測塞來昔布對非小細胞肺癌體內(nèi)的增殖抑制作用。3.體外侵襲試驗檢測塞來昔布對肺腺癌細胞株A549和肺鱗癌細胞株NCI-H520的體外侵襲的抑制作用。 結(jié)果：1.塞來昔布對肺腺癌細胞株A549和肺鱗癌細胞株NCI-H520均有明顯的體外增殖抑制作用，而且隨塞來昔布劑量的增大和作用時間的延長，抑制作用明顯增強，即有明顯的時間和劑量依賴關(guān)系。2.在相伺條件下，比較塞來昔布對兩種細胞株增殖抑制率，150umol

4、/L塞來昔布作用24小時、100umol/L塞來昔布作用48小時、50～100umol/L塞來昔布作用72小時后，塞來昔布對肺鱗癌NCI-H520的抑制率明顯高于對肺腺癌A549的抑制率(P＜0.05、P＜0.01)。3.塞來昔布可明顯抑制裸鼠移植瘤的生長。在塞來昔布治療組，腫瘤的體積為369.33mm3，重量為0.19g，均明顯低于對照組(P＜0.05、P＜0.01)，抑瘤率為69.35％。4.塞來昔布對NSCLC有明顯的侵襲抑制作用

5、，呈劑量依賴性。25和50umol/L塞來昔布作用24小時，A549穿膜細胞數(shù)分別為122.8和74.2，NCI-H520穿膜細胞數(shù)分別為84.4和53.8，均明顯低于對照組(P＜0.01)。 結(jié)論：1塞來昔布對NSCLC在體內(nèi)外有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性和時間依賴性。2塞來昔布對H520的增殖抑制作用強于對A549的增殖抑制作用，提示塞來昔布對鱗癌的抑制作用強于腺癌。3塞來昔布對NSCLC有明顯的侵襲抑制作用，提示塞來昔

6、布有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲的作用。 第二部分：塞來昔布抑制非小細胞肺癌的作用機制的研究——細胞周期阻滯、誘導(dǎo)凋亡、COX-2依賴機制? 目的：從細胞周期阻滯、誘導(dǎo)凋亡、COX-2依賴機制三個方面探討塞來昔布對NSCLC抑制作用的機制。 方法：1.MTT法檢測加用PGE2后塞來昔布對NSCLC抑制率的改變。2.應(yīng)用透射電鏡形態(tài)學(xué)、流式細胞術(shù)、DNA凝膠電泳分析檢測腫瘤細胞的凋亡。3.應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞周期的分布。4

7、.應(yīng)用RT-PCR檢測P21、P27、XIAP、SurvivinmRNA的表達水平。5.應(yīng)用westernblot檢測survivin、P27KIP1蛋白的表達水平。 結(jié)果：1.PGE2對塞來昔布抗NSCLC細胞增殖作用無影響，100umol/L塞來昔布+200umol/L的PGE2、100umol/L塞來昔布+300umol/L的PGE2作用24小時～72小時，其增殖抑制率與對照組(單獨100umol/L塞來昔布)無差異。2.

8、誘導(dǎo)凋亡的作用：透射電鏡、DNA凝膠電泳分析證實了塞來昔布組凋亡的存在，流式細胞儀檢測25-150umol/L塞來昔布作用于A549細胞24小時后所誘導(dǎo)的凋亡率分別為15.7％、26.8％、76.2％、86.7％，其中50-150umol/L塞來昔布組凋亡率顯著高于對照組(P＜0.05)，組間有顯著性差異(P＜0.05)；25-150umol/L塞來昔布作用于NCI-H520細胞24小時后所誘導(dǎo)的凋亡率分別為11.8％、15.7％、41

9、.1％、80.0％，其中100-150umol/L塞來昔布組凋亡率顯著高于對照組(P＜0.05)，組間有顯著性差異(P＜0.05)。3.細胞周期的改變：A549細胞經(jīng)25-100ummol/L塞來昔布作用后,G0/G1細胞比例為85.42％、86.47％、84.73％、88.7％，100ummol/L組明顯高于對照組(P＜0.05)。NCI-H520細胞經(jīng)25-100ummol/L塞來昔布作用24小時后，G0/G1細胞比例分別為62.3

10、7％、64.86％、66.04％、70.41％，其中50-100umol/L組G0/G1細胞比例顯著高于對照組(P＜0.05，P＜0.01)。4.50-150umol/L塞來昔布作用24小時后，NSCLC細胞的survivinmRNA及蛋白的表達逐漸降低，成劑量依賴性。5.50-150umol/L塞來昔布作用24小時后，NSCLC細胞的XIAPmRNA的表達逐漸降低。6.50-150umol/L塞來昔布作用24小時后，NSCLC細胞P2

11、1mRNA的表達逐漸增加，成劑量依賴性。7.50-150umol/L塞來昔布作用24小時后，NSCLC細胞P27mRNA及蛋白的表達逐漸增加，成劑量依賴性。 結(jié)論：1PGE2不能逆轉(zhuǎn)塞來昔布對NSCLC的增殖抑制作用，表明塞來昔布對非小細胞的抑制作用為非COX-2依賴途徑。2塞來昔布抑制NSCLC的機制涉及細胞周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡兩方面。3塞來昔布誘導(dǎo)NSCLC細胞凋亡的機制可能通過降低XIAP、survivin的表達而誘導(dǎo)凋亡的

12、發(fā)生。4塞來昔布導(dǎo)致細胞周期阻滯的機制是通過增加P21WAF1、P27KIP1的表達水平，導(dǎo)致細胞阻滯于G0/G1期。 第三部分：塞來昔布對非小細胞肺癌的放療和化療的增敏作用及機制 目的：探討塞來昔布對NSCLC的放療和化療增敏作用及其機制。 方法：1.MTT法檢測放療、順鉑(DDP)、足葉乙甙(VP16)單獨應(yīng)用的增殖抑制率及與塞來昔布聯(lián)合應(yīng)用的增殖抑制率，并根據(jù)金氏公式計算Q值，評價兩藥的合用效應(yīng)。2.應(yīng)用流

13、式細胞術(shù)檢測各處理組的凋亡率。 結(jié)果：1.DDP對肺腺癌、鱗癌細胞株均有明顯的體外抑制作用，且抑制作用呈劑量依賴型和時間依賴性。2.1.25、2.5mg/L的DDP分別聯(lián)合25、50umol/L塞來昔布后對NSCLC抑制作用明顯增強，且兩藥聯(lián)合的Q值＞1.15,二者合用有協(xié)同作用。3.VP16對肺腺癌、鱗癌細胞株均有明顯的體外抑制作用，且抑制作用呈劑量依賴型和時間依賴性。4.1.25、2.5mg/L的VP16分別聯(lián)合25、50u

14、mol/L塞來昔布后對NSCLC抑制作用明顯增強，且兩藥聯(lián)合的Q值＞1.15,二者合用有協(xié)同作用。5.50umol/L塞來昔布與2.5mg/LDDP聯(lián)合作用于A549、H520細胞24小時，凋亡率為55.27％和42.93％，聯(lián)合用藥的凋亡率明顯高于單用藥組(P＜0.01)。6.3Gy放療聯(lián)合25-75umol/L塞來昔布作用24-72小時抑制率均顯著高于單獨放療組，且隨塞來昔布劑量增大、作用時間的延長，抑制率明顯增加。7.放療聯(lián)合50